Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Сохранение ферментов в активном состоянии
251
определению их структуры, были получены с внеклеточными ферментами, которые обычно представляют собой небольшие жесткие белковые молекулы. Часто их содержание во внеклеточной жидкости составляет значительную долю общего количества белка. Естественная среда внутри клетки сильно отличается от внеклеточной. Растворимые белки, как цитоплазматические, так и локализованные внутри органелл, находятся в очень концентрированном белковом «бульоне» (обычно не менее 100 мг-мл”1), а в митохондриальном матриксе их содержание доходит до 400 мг*мл-1 [24]. Как правило, <в клетке наблюдается относительно низкое напряжение 02 (в некоторых случаях оно равно нулю), и в ней присутствуют различные восстанавливающие соединения, такие, как глутатион, поддерживающие высокий восстановительный потенциал. В клетке содержатся также в достаточно больших количествах метаболиты, способные стабилизировать ферменты. Как только ткань разрушена, белки освобождаются из своего защитного окружения, растворяются в экстрагирующем буфере, который может быть полностью насыщен кислородом. Освобождаются также и протеолитиче-ские ферменты, находившиеся в изолированных лизосомных компартментах внутри клетки. Ферменты подвергаются воздействиям трех типов, которые могут привести к потере активности: 1) денатурации, 2) инактивации каталитического центра и 3) протеолизу.
Инактивация каталитического центра может быть обусловлена утратой кофакторов и диссоциирующих простетических групп, а также химическими изменениями аминокислотных остатков в активном центре.
Денатурация
Денатурация белка может быть сведена к минимуму, если исключить основные денатурирующие факторы. К ним относятся крайние значения pH и температур, а также такие денату-ранты, как органические растворители (см. разд. 3.5). Естественная величина pH внутри клетки обычно находится в пределах 6—8, поэтому буферы, pH которых лежит в этой области или очень близок к фактическому значению в данной ткани, должны защищать ферменты от денатурации под' действием крайних значений pH. Следует отметить, что физиологическое значение pH в большинстве животных клеток составляет 7,0— 7,5 при 37 °С. Из-за влияния температуры на присутствующие компоненты буфера эквивалентное физиологическое значение рн при температуре около 0 °С для тканей животных ближе к 8,0, чем к 7,0. Некоторые проблемы контроля pH при приготовлении экстракта обсуждались ранее (см. разд. 2.3).
252
Глава 6
Всегда принималось как нечто само собой разумеющееся, что очистка ферментов должна выполняться на холоде из-за того, что ферменты весьма лабильны; снижение температуры на 20 °С понижает скорость большинства процессов в 3—5 раз, и потому проведение операций с ферментами на холоде более целесообразно. Однако низкая температура замедляет также и процессы, связанные с разделением, например при ионообменной хроматографии; следовательно, если при этом приходится увеличивать время разделения в той же самой степени, то никакого выигрыша не достигается. Это не относится к денатурации, так как она очень сильно зависит от температуры (см. разд. 3.5). Но большинство белков, особенно у теплокровных млекопитающих, проявляет незначительные признаки тепловой денатурации при температуре ниже 40 °С, если значение pH близко к физиологической величине, они сохраняются в этих условиях в течение нескольких дней. Только у видов с постоянно холодными тканями, например у рыб, обитающих в холодной воде, тепловую денатурацию может вызвать и комнатная температура. Некоторые ферменты даже денатурируют (изменяют свои естественные свойства) под воздействием холода — явление, известное как холодовая денатурация, — в результате ослабления гидрофобных взаимодействий, стабилизирующих структуру молекулы. Поэтому, хотя обычно и рекомендуется держать растворы на льду в то время, когда они не подвергаются фракционированию, иногда при проведении фракционирования их лучше подогреть. Часто нет необходимости работать в холодной комнате; всегда удобнее этого не делать.
Избирательная денатурация, а также использование органических растворителей в процессе фракционирования обсуждались ранее (см. разд. 3.4 и 3.5). Применение последнего метода обычно требует низких температур для предотвращения денатурации. В противном случае белковые растворы нельзя подвергать действию органических растворителей или других денату-рантов, таких, как мочевина или додецилсульфат.
Инактивация каталитического центра
Труднее избежать инактивации ферментов в результате специфических воздействий на каталитический центр. Утрату кофакторов можно предотвратить (если они известны), добавив их вновь к раствору фермента или включив их в используемые буферы. Перед определением ферментативной активности может потребоваться предварительная инкубация фермента с кофактором; апофермент обычно не менее стабилен, чем голофермент, поэтому большая часть утраченной активности может быть восстановлена. Более серьезную проблему представляют
