Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Буфер сохраняет почти постоянное значение pH, связывая протоны, образующиеся в других реакциях или, наоборот, освобождая их, если они потребляются в каких-то других процессах. Буферное действие раствора оптимально, когда обе эти возможности реализуются в равной степени, но в некоторых случаях, например когда известно, что протоны должны освобождаться, оптимальное буферное действие раствора может проявляться и тогда, когда в избытке имеется основная форма буфера,— это зависит от того, насколько сильным должно быть за-кисление и какое изменение pH допустимо. Самый простой пип буфера — это тот, в котором одна из форм не заряжена, т. е.
НА = Н++А"
или
НВ+ = Н++В
Константа диссоциации в первом случае определяется как
к _ [Н+][А-]
” [НА] ’
Сохранение ферментов в активном состоянии
24!
а во втором случае как
к [Н+][В]
Л° — [НВ+]
и обычно выражается в логарифмической форме
р/(а = —lg/Ca.
Таким образом,
рКа = —log [Н+]—log |HAj = pH—log jHAj .
Это уравнение Хендерсона — Хассельбаха, из которого перестановкой можно получить значение pH раствора, содержащего обе формы буфера:
pH = рка 4-lg 1?с1Явна11°.РМ..
г г а I & [кислотная форма]
новная форма]= новная форма]= [основная форма
Данное уравнение применимо к обоим типам буферов — НА и НВ+. Простые расчеты показывают, что рН = р/Са, когда [ос-[кислотная форма], рН = р/Са+1, когда [ос-ОХ [кислотная форма], и pH = p/Ca— 1, когда =0,1 X [кислотная форма]. Обычно желательно работать в интервале около 0,5 единицы рКа, так как в этом случае а) присутствует достаточное количество каждой формы и б) чем ближе значение pH к рКа, тем меньше изменяется рн в расчете на каждый освобожденный или поглощенный протон.
В приведенных ниже уравнениях используются следующие члены: г — заряд данного компонента буфера и п — величина, равная 2г—1, где z — заряд кислой формы буфера.
Величина и полезна тем, что указывает на влияние ионной силы на величины рКа (см. ниже). По определению, п всегда является нечетным числом.
p/(°a = —lg (константа кислотной диссоциации), экстраполированный к нулевой ионной силе. р/Ст = р/Са, где т — порядковый номер стадии диссоциации, считая от самого низкого значения pH (для многозарядных буферов).
/= ионная сила= -j- ^C,(z,)2, где Ci — концентрация; заряженных компонентов и 2, — их заряд.
Для простоты допускается, что коэффициенты активности равны единице; при более высоких концентрациях это предположение становится менее оправданным.
16—1078
242
Глава 6
Необходимая концентрация буфера в действительности является свойством самой системы, а не буфера, хотя, если приходится работать при крайних значениях в рабочем интервале pH, например в области, отличающейся на одну единицу pH от рКа, необходимо использовать большее количество буфера для сохранения буферной емкости. Полезно знать, в каком направлении с наибольшей вероятностью может произойти изменение pH, с тем чтобы буфер мог титроваться и противостоять изменению pH — тем сильнее, чем больше это изменение. Например, предположим, что нам нужен раствор с pH 6,5 и максимальным буферным действием при низкой ионной силе, устойчивый к за-кислению. Может подойти имидазольный буфер, но, так как его р/Са равно 7,0, закисление раствора ниже pH 6,5 будет сопровождаться снижением его емкости. В то же время при использовании гистидина (р/Со 6,0) буфер будет дотитровываться в процессе закисления и по мере приближения pH к величине рКа емкость буфера будет увеличиваться. С другой стороны, если необходимо, чтобы буфер был анионным, наиболее подходящим в этом случае будет iV-морфолиноэтансульфонат (МЭС,
рКа 6,2).
Многие буферы, применявшиеся в прошлом, теперь используются реже, поскольку существуют другие, более подходящие буферные системы. К таким выходящим из употребления буферам относятся малеат, рКа 6,3 (обычно в форме трис-малеа-та, который охватывает большой диапазон pH, хотя и со слабым действием около pH 7,0), так как он поглощает в УФ-све-те и имеет п=—3 (см. ниже); барбитон, р/Са 8,0 (поглощает в УФ-свете и токсичен; известен также как веронал); глицилгли-щин, рКа 8,2 (трицин имеет значительно лучшие характеристики и дешевле); какодилат, рКа 6,2 (токсичный и дорогостоящий) и лимонная кислота, р/Сг 4,8, р/Сз 6,4 (связывается с некоторыми белками, образует комплексы с металлами и имеет значение п = —3 или —5).
Для буфера уксусная кислота/ацетат кислотным буферным компонентом служит СН3СООН, у которой z=0 и п ——1. В лимонной кислоте (рКз) роль кислотного компонента играет цитрат2- (г=—2, п=—5), а в трис-буфере — Н-трис+ (z= + l, л = + 1).
Влияние температуры и ионной силы на величины рД'а
Для данной концентрации буфера ионная сила тем выше, чем больше [п] превосходит единицу. Наиболее существенно то, что п является важным показателем влияния ионной силы на величину рКа- Параметр п входит в упрощенное уравнение
