Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 100

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 145 >> Следующая

Сохранение ферментов в активном состоянии
255
ковалентные модификации активного центра в результате воздействия на фермент неблагоприятного окружения. Активный центр фермента содержит аминокислотные остатки, которые чрезвычайно реакционноспособны и поэтому ответственны за каталитические свойства фермента. Эти остатки также более, чем другие, восприимчивы к модификации. Наибольшие трудности встречаются с цистеином; сульфгидрильные группы в активном центре могут находиться в ионизированной форме, которая очень склонна к окислению. Обычно восстанавливающие условия и наличие других сульфгидрилсодержащих молекул внутри клетки защищают эти группы. При более высоком напряжении кислорода в клетке сульфгидрильные группы могут вступать в следующие реакции: а) образование дисульфидной связи: —S—S—; б) частичное окисление до сульфиновой кислоты: —S—ОН; в) необратимое окисление до сульфокислоты:
Для образования дисульфидной связи необходимо, чтобы другая сульфгидрильная группа находилась рядом и чтобы происходил процесс окисления. Образование дисульфида значительно ускоряется в присутствии двухвалентных ионов, которые способны активировать молекулы кислорода и образовывать комплексы с сульфгидрильными группами. Существуют два метода защиты сульфгидрильных групп: 1) удаление всех следов ионов (тяжелого) металла с помощью комплексообразующего агента, например ЭДТА, и 2) введение в раствор сульфгид-рилсодержащего реактива, такого, как fi-меркаптоэтанол или дитиотреитол либо дитиоэритритол (реактивы Клеланда) [156]:
p-Меркаптоэтанол выпускается в виде тяжелой пахучей жидкости. В качестве защитного агента его следует использовать в концентрации между 5 и 20 мМ; в более низких концентрациях он быстро превращается в дисульфид в результате окисления. Защитная способность его утрачивается в пределах 24 ч, если раствор не содержат в анаэробных условиях, так как любой образовавшийся дисульфид может обмениваться со все еще активными сульфгидрильными группами, оставшимися в белке.
HOCHaCH2SH
CH2-SH
р -Меркаптоэтанол СН2—SH
СН2—SH Дитиотреитол
СН2—SH Дитиоэритритол
254
Глава 6
сн2сн2он
SH
SH
\
сн2сн2он
+ *02
сн2сн2он
HS
HS-белоК
ОНСН2СН2—S-S-белок
Рис. 6.3. Инактивация каталитически активной сульфгидрильной группы в ферменте окисленным р-меркаптоэтанолом.
Окисленный p-меркаптоэтанол способен даже ускорять процесс инактивации (рис. 6.3).
Хотя образование дисульфидной связи обратимо, оно нежелательно. Дитиоаналоги восстановленных сахаров треитола и эритритола представляют собой белые твердые вещества, которые в очищенном виде имеют очень слабый запах. Для того чтобы обеспечить их защитное действие в течение 24 ч, достаточна концентрация, составляющая лишь 0,5—1 мМ, так как дисульфид, образовавшийся в результате окисления, — это стабильный внутримолекулярный дисульфид, который не обменивается с сульфгидрильными группами белка (рис. 6.4).
Другие используемые сульфгидрильные защитные реактивы со свойствами, близкими к меркаптоэтанолу, это 2,3-димеркап-топропанол, тиогликолат, глутатион и цистеин. Цистеин окисляется довольно быстро, особенно в присутствии ионов тяжелых металлов.
/СН2 sh ,сн
н—с—он н—с-он s
I + -1о2 -----I I
он—С—Н НО—С-Н S
\ \ /
CHj-SH СН2
Рис. 6.4. Окисление дитиотреитола с образованием неактивного циклического дисульфида.
Сохранение ферментов в активном состоянии
255
Обычно для получения хороших результатов используют меркаптоэтанол (если он необходим), разведенный в момент приготовления в соотношении 1:1000 (~12 мМ), а для более длительного хранения применяют дитиотреитол в концентрации 1—5 мМ. ЭДТА, как правило, присутствует во всех буферах в концентрации 0,1—0,2 мМ. Однако встречаются случаи, когда присутствие комплексообразующего агента приносит вред, так как он может удалять из активного центра фермента важные для его функционирования ионы металлов. Тогда могут понадобиться очень чистые соли, не загрязненные тяжелыми металлами, или, возможно, будет достаточно более слабого комплексообразующего агента (например, имидазольного буфера).
Здесь следует сказать несколько слов о разбавленных растворах ферментов. Хорошо известно, что очень разбавленные ферментные растворы быстро теряют активность, но эту потерю можно предотвратить, если добавить в раствор относительно большое количество другого белка, чаще всего бычьего сывороточного альбумина (БСА). При процедурах по очистке обычно не добавляют сопутствующего белка, поэтому очень разбавленные растворы следует концентрировать как можно скорее (см. разд. 1.4). Но для измерения ферментативной активности желательно, чтобы конечная концентрация фермента в ходе анализа была очень низкой — до 1 мкг-мл-1. Это может вызвать быструю инакпивацию фермента; даже разведение образца непосредственно перед анализом иногда приводит к потерям. В этих случаях добавление БСА как стабилизатора оправданно и должно всегда использоваться. Характер действия БСА не ясен и, вероятно, включает различные эффекты. Крайняя степень разведения белка может привести к диссоциации субъединиц, которые либо не обладают активностью, либо, даже если они полностью сохраняют активность, становятся нестабильными и быстро денатурируют. Возможно, что БСА взаимодействует непосредственно с разбавленным белком, снижая вероятность его диссоциации или стабилизируя субъединицы. Кроме того, небольшое количество белка, присутствующего в растворе, может адсорбироваться на стенках контейнера, особенно если он стеклянный. 1 мкг белка может быть полностью связан на 5 ем2 стенки контейнера, но в присутствии I мг БСА 1 мкг адсорбированного белка практически полностью будет представлен БСА, и поэтому лишь небольшое количество фермента будет потеряно из раствора. Для разбавления белковых растворов перед анализом следует использовать подходящий буфер, содержащий БСА в концентрации до 10 мг-мл-1, а в самой анализируемой смеси концентрация БСА должна составлять по крайней мере 0,1 мг>мл-1.
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed