Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Иммуноадсорбенты Контактное время составляет не-
сколько часов
Окрашенные адсорбенты** 10---15 см-ч-1 20---30 см-ч-1
Гель-фильтрация:
сефадекс (тонкий) агароза, ульт 2---5 см-ч-*1 4---10 см-ч-1
рагель, сефакрилы 10---15 см-ч"1 20---30 см-ч-1
* Обычно выполняется на холоде, чтобы избежать денатурации при нефизиологпче-ских значениях pH.
** «Кинетическая адсорбция» происходит при скорости потока 500 см-ч-1 [12] для очень прочно связывающихся белков.
видно, глицерин в качестве стабилизатора стоит использовать только в том случае, если полученный при этом коэффициент стабилизации превышает указанный временной фактор.
Какое время необходимо для достижения практически полного равновесия?. Нельзя привести точных цифр, так как они варыируют в зависимости от условий (крупные белки диффундируют более медленно, чем мелкие, в результате чего временной фактор может измениться в два раза). Но в общем можно использовать приблизительные данные, приведенные в табл. 7.2.
Общее время, затрачиваемое на каждую стадию фракционирования, теоретически не зависит от объема, но на практике работа с большими объемами неизбежно занимает больше времени. Это обсуждается далее в разд. 7.3. Учитывая, что чем быстрее осуществляется выделение, тем менее вероятно, что конечный продукт будет разрушен, следует принимать какие-то компромиссные решения относительно целесообразности соблюдения идеальных условий. Например, можно рассуждать следующим образом: «Если я проведу разделение на колонке в холодной комнате при оптимальной скорости потока, то фермент выйдет из колонки примерно в 20.00 и его можно будет оставить в пробирках в коллекторе фракций до утра. С другой стороны, если я проведу разделение при комнатной температу-
266
Глава 7
ре и быстрее, чем при оптимальной скорости потока, разделение будет несколько хуже, но зато оно закончится к 16.00 и у меня будет время сконцентрировать препарат и заморозить его». В данном примере, работа в холодной комнате будет продолжаться 24 ч при 4 “С, прежде чем можно будет перейти к следующему этапу. При комнатной температуре пройдет только 5—6 ч до того, как образец будет помещен на хранение. С одной стороны, может оказаться, что препарат, полученный в холодной комнате, сильнее разрушен в результате протеолиза или инактивирован вследствие длительного пребывания его в разбавленном растворе; с другой стороны, препарат, выделенный при комнатной температуре, может быть более загрязнен нежелательными белками. Цель всех этих рассуждений заключается не в том, чтобы рекомендовать какую-то одну из этих двух процедур, а в том, чтобы просто указать читателю на два возможных варианта.
Некоторые ферменты необыкновенно устойчивы к инактивации, вызываемой любым из факторов, описанных в разд. 6.2. Часто это отмечается даже тогда, когда процедура очистки продолжается в течение нескольких недель. Внеклеточные ферменты отличаются большой устойчивостью потому, что они существуют в более жестких природных условиях. В таких случаях быстрота операций не имеет большого значения, если решены проблемы протеолитической инактивации. Но в других случаях, когда стабильность фермента не столь велика, скорость операций может быть гораздо важнее, чем разрешение, достигаемое на каждом этапе, даже если это означает включение дополнительной стадии очистки для окончательного удаления из препарата примесей. При очистке нестабильных ферментов следует исключать диализ и гель-фильтрацию на медленно фильтрующих средах. Если это возможно, то одна стадия фракционирования должна следовать за другой без длительной подготовки. Так, после солевого фракционирования может идти гель-фильтрация, поскольку на этой стадии удаляется соль и в то же время происходит фракционирование белков. Но после солевого фракционирования нельзя сразу же использовать метод ионного обмена. Его можно применять только в исключительных случаях, когда соль, содержащаяся в осадке, не препятствует адсорбции нужного белка. Непосредственно после стадии ионного обмена невозможно использовать гель-фильтрацию, так как фракции нужно сконцентрировать, — очень редко при элюции с ионообменника получается острый пик, содержащий концентрированный раствор данного вещества (см., однако, обсуждение аффинной элюции в разд. 4.4 и хроматофокуси-рования в разд. 4.3). После фракционирования смеси с помощью органического растворителя может следовать ионный
Таблица 7.3. Возможные последовательности процессов фракционирования с указанием промежуточных стадий
Фракционирование неорганическими солями—^-непосредственно за ним следуют: Гель-фильтрация
| Гидрофобная хроматография
Обессоливание на колонке с гель-фильтрующим материалом, например G-25 (ср. с табл. 1.2)
Ионный обмен, аффинная адсорбция, фракционирование органическими растворителями и т. д.
