Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
5.5. УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИЯ
Последний метод, о котором будет рассказано -в этой главе, — это ультрафильтрация с использованием давления газа для продавливания жидкости через мембрану (см. рис. 1.13,Б). Если поры в мембране таковы, что более мелкие молекулы белка проходят через нее с «ультрафильтратом», то достигается разделение белков. Молекулы большего размера удерживаются и концентрируются по отношению к исходному раствору. Поскольку в ультрафильтрационной мембране имеется некоторый
238
Глава 5
разброс размеров пор, не существует резкой границы пропускания. Часть молекул с размерами, близкими к размерам пор в области пропускания, будет проходить через мембрану, а остальные останутся в исходном растворе. Однако если у нужного белка размер молекул значительно меньше или больше (скажем, по крайней мере на 30—50%), чем установленный верхний предел пропускания, то почти весь белок окажется или в ультрафильтрате, или в «удержанном» растворе.
По своей разделительной способности этот метод, безусловно., хуже, чем гель-фильтрация (основанная на том же принципе— разделении молекул в соответствии с их размерами), так как он позволяет получить только две фракции: «более
крупные молекулы» и «более мелкие молекулы». Вместе с тем в некоторых случаях он имеет ряд преимуществ, особенно если
м
Ж
I
JEL-
м
in.
О п
Молекулярная масса х 10
Рис. 5.27. Возможное распределение белков по размерам и количеству до (Л) и после (5) ультра фильтрации через мембрану с номинальным размером пор 200 000 дальтон (предполагается, что все белки сферические).
Разделение в растворе
239
получен большой объем разбавленного раствора белка, например раствор, элюированный с адсорбционной колонки. Прежде чем подвергать этот раствор гель-фильтрации, его нужно сконцентрировать. Это можно сделать с помощью ультрафильтрации, причем если выбрать мембрану так, чтобы она задерживала только нужный белок, то отделение белков с молекулами меньших размеров можно осуществить без дополнительных усилий. Ультрафильтращия особенно полезна при очистке белков больших размеров. Предположим, например, что интересующий нас белок имеет мол. массу 300 000, а другие белки распределяются по размерам и количеству, как показано на рис. 5.27, А, При использовании мембраны с номинальным «отсекающим» размером пор 200 000 дальтон большая часть белков с мол. массой меньше, чем 150 000, пройдет через мембрану и конечное распределение будет таким, как показано на рис. 5.27, Б. В этом примере более половины всего белка удаляется из раствора, что позволяет сконцентрировать «удерживаемый» раствор белка до меньшего объема. С другой стороны, результаты последующей гель-фильтрации будут такими, как если бы более мелкие молекулы белков не были удалены посредством ультрафильтрации. Но так как в растворе теперь содержится меньше белка, можно использовать гель-фильтрующую колонку меньшего размера.
Ультрафильтрация замедляется по мере того, как повышается концентрация белка, поэтому, прежде чем наконец собрать удерживаемый раствор, полезно один или два раза разбавить концентрируемый раствор буфером. Это менее желательно, когда нужный белок находится в ультрафильтрате, так как он уже разбавлен и при добавлении буфера разбавится еще больше. Вторая ультрафильтрация с применением мембраны, имеющей более мелкие поры, может быть использована для концентрирования первого ультрафильтрата,
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Fischer L. (1980). Gel filtration chromatography. In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology (Work T. S. and Burdon R. H., eds.), vol. 1, Part II, rev. ed., Elsevier/North-Holland, Amsterdam.
Gordon A. H. (1979). Electrophoresis of proteins in polyacrylamide and starch gels. In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology (Work T. S. and Burdon R. H.f eds.), vol. 1, Part I, rev. ed.> Elsevier/North-Holland, Amsterdam.
Pharmacia Fine Chemicals AB Publications (1980). Gel filtration: Theory and practice, Uppsala.
ГЛАВА 6
СОХРАНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ В АКТИВНОМ СОСТОЯНИИ
6.1. КОНТРОЛЬ pH: БУФЕРЫ
Одно из главных требований, которые должен выполнять экспериментатор при работе с ферментами, — это постоянно следить за величиной (pH; важное значение имеет буфер, с помощью KOTqporo можно контролировать pH. Необходимо также знать характеристики используемого буфера и !иметь под рукой набор различных буферов, чтобы можно было выбрать из них наиболее подходящий. За несколько десятилетий, в течение которых проводилось исследование ферментов, было использовано большое число различных буферов, и до сих пор все еще продолжается разработка новых буферных систем. Полезно знать следующие характеристики используемого буфера: 1) величину р/Са; 2) изменение рКа с температурой и ионную силу; 3) анионные, катионные или множественные заряды на компонентах буфера; 4) взаимодействие с другими компонентами, например с ионами металлов; 5) растворимость; 6) стоимость; 7) поглощение в УФ-свете.
