Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Сохранение ферментов в активном состоянии
243
Таблица 6.1. Влияние ионной силы на рКа некоторых типичных буферных растворов1*
п Р К°а Р Ка, Р*а, Концентрация компо
7=0,01 /-0,1 нентов буфера при
рН"-р/Са. когда /-0Л
целиком определяется
буфером
Ацетат ---1 4,76 4,72 4,66 0,2
Фосфат ---3 7,20 7,08 6,89 0,05
Цитрат ---5 6,40 6,29 5,88 0,022
1 рис +1 8,С6 8,10 8,16 0,2
*) Теоретически вычислено из уравнения (6.1) при 25 °С.
Дебая — Хюккеля, связывающее значения рКа и рК°а (1=0):
р*.=рк«°+тйш* <ПРИ 25°С)- <61>
Таким образом, величины п, превышающие единицу, приводят к большему влиянию ионной силы на рКа\ это особенно ха* рактерно для цитрата (табл. 6.1), у которого п = —5 в области pH, где обычно используется цитрат. Следует отметить, что для катионных буферов, таких, как трис, рКа повышается с увеличением ионной силы. Влияние ионной силы следует учитывать при приготовлении исходных буферных растворов более высокой концентрации по сравнению с концентрацией используемых буферов.
Температура также влияет на значения р/Сй, особенно в случае буферов, содержащих амины. О влиянии температуры на буферное действие можно судить по термодинамическим выражениям
din Ка dpKa АЯ°
dT “ ЯТ2 • dT ~ 2,3RT*
И
AG0 = AH°—TASQ = —RT In Ка = 2,3RT рКа.
Следовательно, для буферов с высоким значением рКа величина AG0 имеет большое и положительное значение. В зависимости от энтропии диссоциации АН0 также обычно имеет высокое и положительное значение. Таким образом, степень изменения р/Са с температурой, вероятнее всего, уменьшается, и тем сильнее, чем больше значение рКа* С другой стороны, буферы с низким рКа меньше изменяются с температурой. Энтропия диссоциации очень мала для аминсодержащих буферов, которые широко используются при значениях pH выше 6, что объясняется
16*
244
Глава 6
Таблица 6.2. Термодинамические величины для некоторых буферов1 >
р/со dpKa!dT дяо AGO А&,
^ а при 25 °С (кДж-моль-1) Дж-град-1 *
¦ моль-1
Фосфорная кислота, ---1 2,15 +0,004 -6,8 12,3 -64
Уксусная кислота --- 1 4,76 ---0,0002 0,3 27,3 -90
Лимонная кислота, ---5 6,40 0 0 36,6 ---123
+ 1 6,95 ---0,020 34,0 39,9 -19
Фосфорная кислота, ---3 7,20 ---0,0028 4,8 41,3 ---12
рК2
ТЭС ---1 7,50 ---0,020 34,0 43,0 ---30
Три с +1 8,06 ---0,028 48,0 46,2 6
Аммиак +1 9,25 ---0,031 53,0 53,1 0
Карбонат ---3 10,33 ---0,009 15,4 59,3 -147
•) Значения АН0, &G° и Д5° были вычислены из значений Р*а И dpKJdT, которые
<5ыли взяты из работ [51, 52].
тем, что при диссоциации буфера с и= + 1 новые заряженные ионы не образуются. Например, в случае триса
Н-трис+ —>• Трис+Н+ AS° = 5,7 Дж-град-1-моль-1.
Изменение энтропии зависит главным образом от степени участия молекул воды в гидратации компонентов буфера; небольшое положительное значение Д5° для триса (табл. 6.2) указывает, что протонированный компонент гидратирован, вероятно, немного больше, чем нейтральная форма:
Н-трис+-(Н20)„ —> Трис-(Н20)т + Н30++(п—т— 1) Н20, где л> (т—1).
С другой стороны, если буфер имеет п=—1, то образуются два новых, ранее не существовавших иона; например, в случае уксусной кислоты
НАс —*¦ Ac'-f-Н+ AS° = —90,5 Дж*град-1-моль-1.
Можно допустить, что если ион ацетата гидратирован в большей степени, чем нейтральная кислота, то некоторые молекулы воды при ионизации становятся «более упорядоченными», и в результате происходит значительное уменьшение энтропии (она приобретает высокое отрицательное значение):
(п-т+ 1)Н20+НАс.(Н20)т —- Н30++Ас“.(Н,0)„, где п>т.
Подобные соображения можно привести и для буферов с п — = —3 и п = —5; в этих случаях чем больше заряжен ион, тем
Сохранение ферментов в активном состоянии
