Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
17*
260
Глава 6
щества; если среди них окажутся компоненты буфера, то pH заметно изменится (см. разд. 2Л). При зам01раживании растворов, содержащих хлориды и фосфаты натрия или калия, pH может измениться от нейтрального до 4 или ниже; натриевые соли усиливают этот эффект [4, 5]. Чем выше концентрация белка относительно буферных солей, тем выше буферная способность самого белка, препятствующая радикальным сдвигам pH во время замораживания. Замораживание при температуре ниже эвтектических точек большинства солей (—25 °С) дает наилучшие результаты, так как даже при сдвиге pH затвердевание белков сведет к минимуму всякую денатурацию. Замораживать же растворы при температурах от —10 до —15 °С это, вероятно, не лучше, чем не замораживать их совсем, по крайней мере в том случае, если образец хранится в течение короткого времени (до 24 ч).
ГЛАВА 7
ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ И СОБЛЮДЕНИЕ РЕКОМЕНДАЦИЙ
В этой главе речь пойдет о последних усилиях, предпринимаемых при очистке белков, когда уже разработан свой собственный метод или испытана одна из опубликованных методик, но ощущается какая-то неудовлетворенность по поводу всей процедуры в целом. Любая схема очистки фермента или другого белка предназначена для того, чтобы достичь одной или всех из нижеперечисленных целей.
1. Высокий общий выход белка по активности.
2. Высокая степень чистоты конечного продукта.
3. Воспроизводимость
а) в пределах лаборатории,
б) при увеличении или уменьшении масштаба операций,
в) в других лабораториях.
4. Экономное использование реактивов и простота оборудования.
5. Возможность проведения работы в удобное для персонала время.
Хотя результаты, указанные в п. 1 и 2, конечно, желательны, в отдельных случаях они могут быть необязательными. Если это новая методика, позволяющая получить полезный препарат, она может быть пригодна для публикации при условии соблюдения п. 3. Прежде чем публиковать данные, необходимо, чтобы был выполнен п. 3, в, который, к сожалению, ттруд-нее всего подтвердить. Очень часто этот пункт не выполняется, и многие опубликованные методики по ряду причин не дают удовлетворительных результатов в других лабораториях. Иногда авторы не достаточно часто применяют свою методику, и разработанная ими система оказывается охарактеризованной менее точно, чем они думают. В некоторых случаях в опубликованной методике отсутствует какая-либо важная информация. Еще одна причина кроется в том, что исходный биологический материал никогда не бывает одинаковым; различия в его экет-рагируемости и составе могут привести к полной неудаче.
Пункты 4 и 5 касаются технических аспектов и относятся не к эффективности самой схемы, а к повседневной организации
18—1078
262
Глава 7
и финансированию работы. Само собой разумеется, что наиболее успешная работа может быть выполнена в хорошо обору* дованной и щедро финансируемой лаборатории. Кроме того, если студенты, занимающиеся исследовательской работой, должны быть подготовлены к тому, что при необходимости им придется работать по 12—16 ч подряд, то не так-то просто, да и нецелесообразно убеждать технический персонал делать то же самое; если процесс может быть заморожен (в буквальном смысле) на полпути и продолжен на следующее утро, то все будут только довольны.
Многие из приведенных ниже замечаний касаются достижения намеченной цели более прямым или коротким путем, а также способов экономии времени или реактивов при точном соблюдении необходимых требований в процессе очистки ферментов. В большинстве случаев эти рекомендации не предназначены для пуристов, так как означают отход от идеальной схемы очистки. Быстрота проведения операций может иметь важное значение в свете решения проблем, обсуждавшихся в разд. 6.2. Поэтому, даже если процедура фракционирования выполняется не совсем идеально, но зато быстро, качество конечного продукта может оказаться выше.
7.1. БЫСТРОТА И РАЗРЕШЕНИЕ: ВРЕМЕННОЙ ФАКТОР
Любой процесс, включающий взаимодействие макромолекул, протекает медленно по сравнению с реакциями, в которых участвуют молекулы небольших размеров,— он может длиться минуты, а не секунды или миллисекунды. Поэтому необходимо, чтобы на каждом этапе фракционирования белка устанавливалось равновесие; для достижения полного или почни полного равновесия может потребоваться 20—30 мин. Предположим, что период полуосаждения (белка) равен 2 мин; зависимость степени завершения этого процесса (в процентах) от времени показана на рис. 7.1. Следует отметить, что через 15—20 мин результат практически не отличается от 100%, но 10 мин недостаточно, чтобы считать процесс «завершенным». Оптимальное время в данном примере составило бы около 15 мин — нет необходимости в более продолжительном ожидании, если только вы не хотите выпить чашку кофе. Обычно никто не удосуживается определить оптимальное время того или иного процесса, тогда как различия в качестве получаемых препаратов могут быть обусловлены слишком быстрым прекращением данной процедуры.
Теперь рассмотрим, чем определяются временные факторы. Прежде всего, большинство процессов (будь то агрегация молекул белка, адсорбция их на твердой матрице или движение
