Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Оптимизация методов и соблюдение рекомендаций
263
в растворе) контролируется диффузией. При уменьшении коэффициента диффузии вдвое время, требуемое для завершения данного процесса, удваивается, и, так как коэффициент диффузии для каждой данной молекулы зависит как от температуры, так и от вязкости среды, оба этих фактора имеют большое значение. Традиционно ферменты считаются настолько лабильными, что во время их выделения всегда стремятся поддерживать температуру около 0°С; большинство препаратов все еще получают при низких температурах. В то же время существует много (а возможно, и большинство) ферментов, которые обладают высокой устойчивостью к денатурации (кроме денатурации, происходящей в условиях фракционирования белков органическими растворителями) при комнатной температуре, особенно когда на фракционирование уходит относительно мало времени. Если разница между температурой холодной комнаты и средней температурой лаборатории составляет 20 °С, то это значит, что скорости химических реакций увеличатся в лаборатории в три-четыре раза. При 25 °С любая реакция окисления, протео-лиз или какой-либо другой вредный для ферментов процесс, кроме денатурации, происходят намного быстрее, чем при 4— 5 °С, однако из тех же соображений можно ожидать, что при любой процедуре фракционирования для достижения равновесия при 25 °С потребуется меньше времени. Это ,имеет особое значение для колоночных методов, так как максимальная скорость операций на ионообменных или гель-фильтрующих колонках определяется скоростью достижения равновесия происходящих во время хроматографии процессов. Если коэффициент диффузии для белка в растворителе при 5 °С в четыре раза ниже, чем при 25 °С, то и скорость потока через колонку должна быть в четыре раза меньше. Однако вязкость воды при 5 °С
18*
264
Глава 7
в 1,8 раза выше, чем при 25 °С; уменьшение коэффициента диффузии при более низких температурах обусловлено главным образом повышением вязкости раствора. Поэтому более вероятно, что коэффициент диффузии уменьшится в два раза, а не в четыре. Таким образом, вследствие того, что скорость потока снижается вдвое, а скорость инактивации фермента — в четыре раза, желательно проводить все операции с ферментами на холоде. Многие исследователи, работающие с ферментами, спокойно оставляют раствор на холоде на ночь, но считают совершенно недопустимым оставлять его при комнатной температуре на час или около того. Однако хранение ферментного раствора в течение 4—5 ч при комнатной температуре эквивалентно хранению его на холоде в течение ночи; если нет уверенности в стабильности полученного препарата, то лучше не делать ни того ни другого, если только такое выдерживание ферментного раствора не является частью процедуры фракционирования.
Как было установлено, во многих случаях необходима стабилизация ферментов глицерином или другими полигидроксили-рованными соединениями. Использовались концентрации глицерина от 20 до 50% (вес/объем). Чистый глицерин почти в 100 раз более вязок, чем вода, хотя, к счастью, для смесей глицерина с водой не наблюдается линейной зависимости вязкости от состава смеси. В табл. 7.1 представлены некоторые величины вязкости для растворов глицерина и сахарозы. Следует отметить, что 25%-ный глицерин имеет в два раза более высокую вязкость, чем вода, а у 50%-ного глицерина вязкость в шесть раз выше, чем у воды. Таким образом, процессы, стабилизирующиеся при наличии в среде глицерина в таких концентрациях, требуют дополнительного времени для своего завершения. Раствор, содержащий 25% глицерина, при 5°С должен проходить через колонку в четыре раза медленнее, чем тот же раствор при отсутствии глицерина и температуре 25 °С. Оче-
Таблица 7.1. Вязкость растворов сахарозы и глицерина
Концентра Вязкость, сПз
о°с сахароза глицерин,
25 VC 25 °С
0 1,78 0,89 0,89
10 2,46 1,18 1,С6
20 3,77 1,70 1,54
30 6,66 2,74 2,12
40 14,58 5,Ш 3,18
50 5,2
Оптимизация методов и соблюдение рекомендаций
265
Таблица 7.2. Приблизительное время и скорость потока, необходимые для достижения условий, близких к равновесным, при фракционировании белков
Метод 5 °С 25 °С
Фракционирование сернокислым ам 20---30 мин 10---15 мин
монием
Осаждение органическими раствори 15---20 мин (Не применяется)
телями
Изоэлектрическое осаждение 20---30 мин 10---15 мин*
Ионообменники:
КМ- и ДЭАЭ-целлюлозы 10---15 см-ч-1 20---30 см-ч-1
КМ- и ДЭАЭ-агарозы, сефацел 15---20 см-ч-^1 30---40 см-ч-1
Аффинные адсорбенты** 5---10 см-ч-1 10---20 см-ч-1
