Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
[50, 51]. Идеальная серия буферов состояла бы из двух наборов, один с п = — 1, а другой с п= +1. Рекомендуемые буферы для ионообменной хроматографии перечислены в табл. 4.6. Единственные пробелы, которые в настоящее время нельзя практически заполнить из-за отсутствия соответствующих бу-
Сохранение ферментов в активном состоянии
247
феров, следующие: а) буфер с п=—1 и р/Са около 5,5, который не поглощает в УФ-диапазоне спектра; б) буфер с п= + 1 и рКа около 5,5, который не испаряется и не поглощает в УФ-об-ласти; в) буфер с п— +1 и рКа около 6,0, который не образует комплексы с ионами металлов.
Приготовление буферных растворов
Чтобы приготовить буферный раствор, взвешивают соответствующие количества каждой формы буфера, навески растворяют в воде и смесь доводят до нужного объема. Однако, чтобы избежать возможной ошибки, рекомендуется всегда проверять pH с помощью рН-метра, особенно если необходимо использовать добавки, например ЭДТА, меркаптоэтанол или хлористый магний. Некоторые компоненты буфера нельзя считать полностью безводными, поэтому для установления точных значений pH, особенно на границах той области pH, где раствор проявляет буферное действие, pH приготовленного раствора следует проверить на рН-метре. Ионная сила важна не только потому, что она влияет на значения p/(e, но и потому, что ее изменение играет существенную роль в других методах, таких, как ионный обмен.
Ионная сила буфера зависит от способа его приготовления. Например, 20 мМ триэтаноламиновый буфер с pH 7,5 можно приготовить из 20 мМ триэтаноламина, доведя его pH до 7,5 с помощью НС1; ионная сила этого буфера равна 0,012 (отношение кислотной к основной форме составляет 12:8 при pH 7,5); единственные ионы, присутствующие в буфере, — это Н-триэта-ноламин+ и С1_. Этот буфер можно приготовить иначе — добавив к 20 мМ хлористому триэтаноламину NaOH до pH 7,5; тогда /=0,020, так как в смеси будет присутствовать 8 мМ NaCl. Кроме того, pH триэтаноламина можно довести до нужного значения серной кислотой. Тогда сульфат-ионы с зарядом, равным двум, тоже будут вносить большой вклад в ионную силу; в данном случае / = 0,018. Авторы редко дают подробное описание процедуры приготовления буферных растворов (в том числе и данные о температуре); к счастью, это не всегда нужно. Концентрации используемых буферов довольно .произвольны; не следует считать, что если описанный буфер имел 20 мМ концентрацию, то 21 мМ буфер будет непригоден для работы. Не надо тратить время, отвешивая буферные соли с точностью до 5 или 6 знаков. Даже небольшие отклонения в содержании воды сделают такую точность бесполезной. Если нет специальных указаний, то обычно для доведения pH буферного раствора до нужной величины используют НС1, чтобы снизить pH, и NaOH
248
Глава 6
или КОН, чтобы повысить pH. Для достижения максимальной буферной емкости при данной ионной силе необходимо выполнить следующие требования: 1) подобрать буфер с рКа в пределах 0,5 единицы необходимого pH и с величиной п, равной -И или —1; 2) использовать незаряженную форму буфера и повысить значение pH, если п =—1, или снизить его, если л= + 1; 3) использовать два буфера, один из которых имеет п=—1 и рКа на 0,5—1 единицу выше, чем рКа другого, у которого п = = + 1. Смешайте обе незаряженные формы до достижения соответствующей величины pH. При этом можно добиться абсолютного максимума буферной емкости.
В случае 3, возможно, будет трудно определить ионную силу, особенно если между заряженными формами буферов наблюдаются сильные взаимодействия, но проводимость таких смесей обычно очень низка. Буферы подобного типа широко используются для электрофореза (см. разд. 5.2), например трис-борат (pH 8—9) и имидазол-МОПС (pH 6,8—7,5), так как они имеют низкую ионную силу. Все эти ионы являются буферами, причем ионы большого радиуса отличаются низкой проводимостью.
Полезно иметь ряд исходных буферных растворов, концентрация которых в 10 или даже в 100 раз больше, чем концентрация приготовляемых из них буферов, непосредственно используемых в опыте. Преимущества таких концентрированных буферных растворов заключаются в том, что при хранении они занимают мало места; бактерицидные добавки (например, азид) разбавляются при последующем использовании буфера; буфер можно добавить к не содержащему буфера белковому раствору, не подвергая последний действию крайних значений pH. Но следует помнить, что при разбавлении pH изменяется (рис. 6.2, табл. 6.1).
Часто возникает необходимость регулировать pH белкового раствора. Рассмотрим две ситуации. Первая, когда требуется лишь незначительное доведение pH раствора до значения, находящегося в области pH буферного действия уже присутствующих в растворе солей буфера. В этом случае можно использовать разбавленную слабую кислоту (например, уксусную кислоту с концентрацией не более 1 М) или основание (трис, 1М); раствор необходимо хорошо перемешивать, чтобы локализованные области кислоты или щелочи вокруг капель добавляемого раствора быстро рассеивались. Только тогда, когда величины pH ниже 5 или выше 8, может потребоваться несколько более сильная кислота или основание. Если же наблюдается существенное отклонение pH от нужного значения и в растворе присутствует сильный буфер, можно использовать более концентрированную кислоту (или основание), с тем чтобы не до-
