Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Сохранение ферментов в активном состоянии
249
пустить слишком большого увеличения объема. Чтобы избежать локальных изменений pH до экстремальных значений, добавляемый раствор сам может быть частично нейтрализован.
При использовании 5 М уксусной кислоты, pH 4,5 (NaOH), в качестве концентрированного pH-понижающего раствора ферментная смесь ни в одной своей части не подвергается действию более низких pH, чем 4,5. Для повышения величины pH можно использовать 5 М аммиак, pH 9,5 (НС1).
Вторая ситуация наблюдается тогда, когда конечное значение pH находится за пределами области буферного действия первоначально присутствовавших солей. К раствору можно добавить подходящие буферы еще до доведения pH до нужного значения, но обычно лучше использовать рН-регулирующий раствор, который сам образует буфер, когда pH достигнет желаемого значения. Например, если имеется раствор трис-хлори-да с pH 8 и нужно изменить его pH до 6,5, то при использовании кислотной формы какого-либо буфера с рКа в пределах 6,2-6,8 pH понизится и раствор останется буферным. В данном примере можно использовать 1 М МЭС (кислота) или, если необходим буфер типа n= +1, 1 М гистидин-хлорид.
Если при доведении pH требуется большая точность, то темпе|ратура во время приготовления буфера может иметь очень существенное значение. Часто в описаниях методов очистки ферментов констатируется, что «все процедуры выполнялись при 4 °С»; между тем, вероятнее всего, используемые буферы смешивались при комнатной температуре, так что истинное значение pH при 4 °С было совсем другим. Большинство рН-мет-ров имеет устройство для температурной компенсации, но это не означает, что если прибор установлен на 4°, а работа проводился при 25 °С, то будет сделана правильная компенсация — прибор ведь не может знать, какая величина dpKa/dT соответствует данному раствору. Для приготовления буфера при 4 °С (обычная температура холодной комнаты) необходимо установить компенсатор температуры на 4 °С, поместить электрод в стандартный буфер при 4°С> дать ему охладиться до этой температуры и снять показания прибора при стандартной величине 4 °С. Затем нужно довести буфер, белковый раствор или другой рабочий раствор до желаемой величины pH при 4 °С. В некоторых методах, использующих изоэлектрическое осаждение в присутствии холодного органического растворителя, pH следует доводить цри температуре +2°С и его величина должна быть установлена с точностью ±0,1 единицы. Единственно надежный способ выполнить эти условия — поступить так, как описано выше. Между прочим, изменение pH в присутствии органического растворителя — это еще один фактор, влияющий на величины рКа (см. разд. 3.4).
250
Глава 6
В данном (разделе при рассмотрении буферов мы исходим из предположения, что значение pH в любой момент может быть измерено правильно и точно. Современные рН-метры просты в обращении и надежны в смысле точности, особенно если они снабжены цифровым табло. Тем не менее им свойственны определенные недостатки, проявляющиеся чаще всего при работе с обычным комбинированным стеклянным электродом. Даже если все инструкции выполняются пунктуально, показания могут быть неправильными из-за плохой проводимости и возникновения скачка потенциала на границе жидкости и керамического держателя между измеряемым образцом и раствором КС1 внутри электрода. Иллингворт [155] недавно исследовал это явление и обнаружил, что многие широко используемые и некоторые новые комбинированные электроды дают отклонения величины pH до 0,4 единицы при работе с буферами, имеющими ионную силу, значительно отличающуюся от ионной силы буфера, применяемого для калибровки рН-метра. Мы рекомендуем проверить ваш рН-метр. Для этого установите pH по 50 мМ фосфатному буферу, а затем разведите этот буфер в 10 раз; значение pH должно стать на 0,2 единицы выше (см. рис. 6.2). Если этого не произойдет, то следует осмотреть керамический держатель и осторожно протереть его поверхность, чтобы снять всякий налет. В промежутках между измерениями электрод лучше всего держать в крепком растворе КС1.
В заключение следует отметить, что всегда нужно знать точное значение pH. Если в методе не указываются величины pH — измерьте их сами; различия в результатах, получаемых при использовании того или иного метода, могут быть обусловлены различными значениями pH исходного сырья. Если у вас нет применяемого в данном методе буфера, то надо подумать, имеет ли он какое-то особое значение, или его можно заменить другим буфером со сходными характеристиками.
6.2. СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕ ФАКТОРЫ ДЛЯ ФЕРМЕНТОВ
С тех пор как биохимики начали заниматься очисткой ферментов, они мучаются над решением проблем, связанных с потерей ферментативной активности. Общая причина такого явления заключается в том, что ферменты часто представляют собой лабильные белковые молекулы, которые при освобождении из своего природного защитного окружения подвергаются различным воздействиям, которым они не могут противостоять. Внеклеточные ферменты составляют исключение по той простой причине, что они предназначены самой природой функционировать в менее благоприятном окружении. Именно поэтому многие успехи, достигнутые в первых работах по очистке белков и
