Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 101

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 95 96 97 98 99 100 < 101 > 102 103 104 105 106 107 .. 145 >> Следующая

256
Глава 6
Протеолитическое расщепление ферментов
Живые клетки содержат «инструменты» своего собственного разрушения, а именно деструктивные гидролитические ферменты, такие, как нуклеазы, полисахаридгидролазы, фосфатазы и протеазы (протеиназы, протеолитические ферменты). В клетках млекопитающих они заключены в лизосомы и освобождаются в контролируемых условиях. Эти ферменты обычно действуют на строго определенные молекулы, разрушая их, если это диктуется физиологическим состоянием организма. У растений деструктивные ферменты хранятся в вакуолях; их действие в цитоплазме находится под контролем различных специфических ингибиторов. У микроорганизмов гидролитические ферменты часто обнаруживаются между плазматической мембраной и клеточной стенкой. Их роль заключается главным образом в расщеплении внеклеточных макромолекул. В процессе получения содержащего ферменты клеточного экстракта наблюдающееся в клетке неустойчивое равновесие между отдельными ее компонентами почти неизбежно нарушается, в результате чего эти ферменты смешиваются с содержимым клетки. Протеоли-тическим ферментам уделено здесь особое внимание. Существуют методы, позволяющие свести к минимуму разрушение лизо-сом при экстрагировании мягких тканей животных [157], но во многих случаях, когда разрушение самой клетки требует энергичной гомогенизации, они неприемлемы. Кроме того, при использовании больших количеств исходного материала обработка клеток гормонами или ферментами с целью осторожного освобождения их содержимого непрактична. Следовательно, мы должны принять как факт, что деструктивные ферменты будут присутствовать в экстракте, и с ними надо что-то делать.
Широко распространенные в тканях протеолитические ферменты специфически подавляются ингибиторами, которые представляют собой соединения, образующиеся химическим путем или имеющие биологическое происхождение. К сожалению, есть много протеолитических ферментов различных типов, не все из которых могут эффективно ингибироваться. К основным категориям протеолитических ферментов [158] относятся:
1) сериновые протеазы (например, трипсин, химотрипсин, ферменты эластазы), КФ подкласс 3.4.21; 2) тиоловые (например, папаин, дрожжевая протеиназа В), КФ подкласс 3.4.22;
3) кислые протеазы (например, пепсин, катепсины D), КФ подкласс 3.4.23; 4) металлопротеиназы (например, коллагеназы, многие микробные нейтральные протеиназы), КФ подкласс 3.4.24; 5) карбоксипептидазы (отщепляют С-концевые остатки), КФ подклассы 3.4.16,17; 6) пептидазы (отщепляют
Сохранение ферментов в активном состоянии
257
главным образом N-концевые остатки) КФ подклассы 3.4.11—15.
Основные усилия в решении проблемы протеолитических ферментов были направлены на сериновые протеазы, причем сначала был использован высоко токсичный ДФФ (диизопро-пилфторфосфат); его токсичность обусловлена тем, что он летуч и подавляет другую сериновую гидролазу — ацетилхолин-эстеразу человека, имеющую большое значение для нервной проводимости. Внедрение в практику фенилметилсульфонилфто-рида (ФМСФ) [159], о котором известно, что он не ингибирует ацетилхолинэстеразу, сделало работу химиков по подавлению протеолиза менее опасной; ФМСФ широко используется и в настоящее время. Хотя ФМСФ не очень хорошо растворяется в водных растворах, его можно растворять в ацетоне, перед тем как вводить в экстракт, в котором его конечная концентрация должна быть 0,5—1 мМ. Так как ФМСФ довольно быстро гидролизуется, его следует добавлять прямо в раствор, содержащий сериновые эстеразы, а не растворять в буфере еще до приготовления гомогената. ФМСФ ингибирует также некоторые тиоловые протеазы и отдельные карбоксипептидазы и поэтому является очень полезным реактивом; в присутствии ФМСФ ферменты необратимо инактивируются, так что в дальнейшем добавления ингибитора больше не требуется.
Кислые протеазы не содержат каталитически активных се-риновых или цистеиновых остатков и не чувствительны к ФМСФ. Однако грибы Streptomyces spp. [160] вырабатывают внеклеточный пептид сложной структуры, который представляет собой сильный ингибитор кислых протеаз, таких, как пепсин, катеп-син D и дрожжевая протеаза А. Его называют «пепстатин А», и он эффективно действует даже в такой низкой концентрации, как 10“7 М. Пепстатин А имеется в продаже. Описан целый ряд сходных протеолитических ингибиторов, в том числе лей-пептин — ингибитор некоторых наиболее активных пептидаз. Эти ингибиторы прочно связываются с протеазами, но действие их обратимо, и поэтому в процессе очистки может потребоваться дополнительное добавление их к ферментному раствору. Пепстатин А, связанный с агарозной колонкой (см. разд. 4.5), использовался для очистки катепсина D [161]. Вероятно, можно рассчитывать, что, пропустив экстракт через колонку, содержащую ряд связанных с ней протеолитических ингибиторов, удастся удалить протеазы еще до начала процедуры фракционирования. Ферменты класса металлолротеиназ, активность которых зависит от присутствия двухвалентного металла, ингибируются ЭДТА просто потому, что огт образует комплексы с ионами металлов.
Предыдущая << 1 .. 95 96 97 98 99 100 < 101 > 102 103 104 105 106 107 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed