Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
17—1078
258
Глава 6
Свежеприготовленный экстракт можно обработать 2—5 мМ ЭДТА, 0,5—1 мМ ФМСФ и 10-7 М пепстатином А при условии, что ни один из этих реактивов не оказывает неблагоприятного воздействия на выделяемый фермент.
Другие факторы, стабилизирующие ферменты
1—2%-ные водные растворы белков несравнимы по своей концентрации с естественной средой, окружающей молекулы белков. Обычно все компоненты цитоплазмы (не считая воду) составляют в сумме 10—15% (вес/объем), причем большинство этих компонентов (в основном белки) содержит значительное количество связанной или по крайней мере слабо ассоциированной воды. Исследования ЯМР содержащейся в клетках воды показали, что большая часть этой воды не может свободно перемещаться. Вероятно, белки приспособлены к этим условиям в большей степени, нежели к искусственным растворам, используемым в биохимической лаборатории. Следовательно, стабилизация (против денатурации и других более тонких конфор-мационных изменений, которые приводят к инактивации) может быть достигнута путем имитации условий, обеспечивающих относительно низкую активность воды. Наиболее широко используемый метод заключается в том, что в буферные растворы добавляется глицерин. Это вещество полностью смешивается с водой и образует с молекулами воды сильные водородные связи, эффективно замедляя движение молекул и тем самым снижая активность воды. Недавнее исследование эффекта глицерина позволило предположить, что молекулы белка предпочтительно связывают воду и образующаяся при этом структура обладает меньшей способностью разворачиваться в структурированном растворе глицерина, чем в одной воде [162]. Глицерин применяется в концентрации до 50% (вес/объем), хотя самые высокие концентрации обычно используют при хранении, так как вязкость подобных растворов слишком высока для каких-либо манипуляций, кроме электрофореза. Но смеси, содержащие 20—30% (вес/объем) глицерина, имеют небольшую вязкость, и многие процедуры можно осуществлять в буферах, содержащих такое количество глицерина. Присутствие глицерина незначительно влияет на ионообменную хроматографию; это еще раз указывает на то, что ионный обмен полностью зависит от электростатических взаимодействий. В этот процесс не вовлечены водородные связи и гидрофобные взаимодействия, которые были бы ослаблены глицерином. Высаливание также может зависеть от присутствия глицерина — либо изменяется процент насыщения, требуемый дл-я осаждения белка, либо (если концентрация глицерина слишком высока) осадок невоз-
Сохранение ферментов в активном состоянии
259
можно отдентрифугировать, так как растворитель слишком вязок и плотен.
Стабилизация ферментов глицерином может быть очень эффективным методом; ферменты, которые в обычных условиях инактивируются чрезвычайно быстро, в присутствии глицерина могут оставаться активными в течение нескольких недель. Кро-ме того, поскольку содержащие глицерин растворы или совсем не замерзают, или образуют тонкую взвесь льда в концентрированной смеси глицерин—растворенное вещество, хранение их при очень низкой температуре не наносит ущерба ферменту. Вместо глицерина успешно используются [163] растворы сахаров или полиспиртов (глюкоза, сахароза, фруктоза, сорбит); механизм их действия, вероятно, сходен с механизмом действия глицерина. Другие гидрофильные вещества, например форма-мид и диоксан, имеют тенденцию разрушать ферменты при высоких концентрациях.
Снижение эффективной активности воды, как правило, бывает полезным для ферментов, если оно осуществляется способами, не оказывающими дестабилизирующего действия на белок. Высокие концентрации сернокислого аммония, при которых фермент осаждается, проявляют сильное стабилизирующее влияние, и фактически большинство ферментов, имеющихся в продаже, представляют собой суспензии в 2—3 М сернокислом аммонии. Кроме того, для сохранения активности ферментов, а также для предотвращения бактериального загрязнения используется 50%-ный глицерин или лиофилнзация. Во время очистки ферментов обычно необходимо оставлять фракции на ночь или даже на более длительное время, и в данном случае следует уделять особое внимание оптимизации условий хранения. При фракционировании сернокислым аммонием фермент нужно оставлять в системе, содержащей как можно более высокую концентрацию сернокислого аммония, например в виде осадка, а не раствора, полученного после его повторного растворения. Если нельзя избежать хранения ферментного раствора в отсутствие защитных агентов, то следует оценить относительные преимущества кратковременного замораживания этого раствора или хранения его при температуре около 0°С в присутствии протеолитических ингибиторов. Замораживание может инактивировать ферменты. Чувствительность различных ферментов к замораживанию очень сильно варьирует. Потери всегда будут меньше, если начальная концентрация белка высока. Не рекомендуется замораживать раствор с концентрацией белка ниже чем около 2 мг*мл-1. Следует помнить, что во время замораживания сначала замерзает чистая вода, что сопровождается повышением концентрации белка и других растворимых веществ. Затем выпадают в осадок наименее растворимые ве-
