Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
В некоторых случаях особо тонкого фракционирования градиент с интервалом в 2 ед. pH может оказаться еще слишком «крутым». Продажную смесь с таким интервалом можно в лабораторных условиях разделить на смеси с интервалом в 0,5 ед. pH. Для этого достаточно нровести электрофокусирование смеси амфолитов и после установления градиента pH физически отобрать ту его часть, на которую приходится нужный узкий интервал. Это удобно делать в колонках, где градиент pH соз-
дается в жидкости без носителя. Такие колонки описаны в гл. 4. Отобранную часть градиента используют для нового ИЭФ. Если при этом раствор амфолитов придется разбавлять, например для проведения фракционирования в той же колонке или геле большого размера, то исходную концентрацию амфолитов нужно взять в соответствующее число раз более высокой. При этом и можно потерять внесенную фирмой добавку нейтральных амфолитов. Перед использованием отобранного узкого диапазона pH эту потерю необходимо восполнить.
В некоторых случаях линейный характер градиента pH не является оптимальным — например, когда в одном опыте желательно отделить все не интересующие исследователя белки, не заботясь об их фракционировании, но одновременно провести тонкое разделение белков, лежащих в определенном узком диапазоне pH. Для этой цели удобен градиент с «площадкой» (рис. 6). Из рисунка видно, что в интервале pH 7—8 градиент пологий — растянут на большую часть длины геля или колонки. Такую форму градиента нетрудно получить, если к раствору с умеренной (0,5—1%) концентрацией амфолитов широкого диапазона pH добавить в такой же или большей концентрации амфолиты для интересующего интервала pH. Благодаря своей повышенной (суммарной) концентрации амфолиты добавленного интервала оттеснят другие амфолиты к краям градиента, куда в процессе ИЭФ отойдут и ненужные белки. В то же время для представляющих интерес белков будут созданы условия тонкого фракционирования в пологом градиенте pH. Отметим попутно, что и сами белковые полосы в пологих градиентах pH оказываются шире, что практически не очень мешает их разделению, но позволяет увеличить загрузку градиента белком.
Аналогичный простой и дешевый способ улучшения разделения белков с близкими значениями pi (изоферментов) был предложен Касперсом и др. [Caspers et al., 1977]. Вместе с ам-фолитами в гель вносили в довольно высокой концентрации (1—4%) природные или неприродные аминокислоты, выбирая их таким образом, чтобы pi аминокислоты была близка к pi фракционируемых белкой Эти аминокислоты и создавали пологий участок градиента в области фокусирования нужных белков.
Упомянем также возможность использования при ИЭФ в аналитических целях аффинных взаимодействий, например бел-
Рис. 6. Нелинейный градиент pH
(с «площадкой»)
/—расстояние вдоль градиента
ков с лигандами. Последние могут быть заполимеризованы ИЛ1 механически задержаны в геле. Обладающие сродством к ли ганду белки в этом случае не покидают зоны внесения препара та, что проявляется в отсутствии соответствующих полос npi сравнении с картиной ИЭФ в контрольном геле [HoreiSi, Ticha 1981].
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АМФОЛИТОВ
Некоторые физико-химические особенности современны: амфолитов для ИЭФ не позволяют пока считать их вполне со вершенными в отношении функций, которые они выполняют Желательно, например, чтобы амфолиты максимально отлича лись от белков по способу окраски, легкости отделения и др Подробно изучены в этом плане амфолины фирмы «LKB». Ока залось, что они окрашиваются нингидрином и многими краси телями для белков; правда, ниже приведены рецепты красите лей, позволяющих в значительной степени обойти это затруд нение. Молекулярная масса амфолинов ограничена, как указы валось, в основном интервалом в 300—900 дальтон, что позво ляет отделить их от сфокусированных белков после опорожнени: колонки или элюции из геля с помощью гель-фильтрации, диа лиза или высаливания. Однако, хотя и в небольшом количест ве, среди амфолинов имеются молекулы с массой 20—30 тыс
Ультрафиолетовое поглощение амфолинов вблизи 280 нм не велико, но не равно нулю, особенно в интервалах pH 9—11 i
3.5—5. Амфолины последнего интервала обладают хорошо вы раженным максимумом поглощения вблизи 310 нм.
За счет присоединения к двум соседним азотпым группиров кам амфолины способны хелировать металлы. При этом наи большей активностью отличаются амфолины интервала pi-
8.5—10. Это обстоятельство может неблагоприятно сказывать ся на биологической активности некоторых металлопротеидов По сравнению с ЭДТА хелирующая способность амфолинов дл$ большинства металлов невелика. Исключением служит двухва лентная медь — для нее амфолины выступают в роли столь ж< эффективных хелирующих соединений, как ЭДТА, поэтому медьсодержащие белки легко могут ими инактивироваться. Дл? уменьшения этой опасности такие белки следует вносить в гел! для ИЭФ после установления градиента pH со стороны кисло го его конца. К счастью, инактивация ферментов вследствие утраты ионов металла редко бывает необратимой.
