Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
накладывают насыщенный раствором кусочек поролона. Часто белковым раствором пропитывают квадратик фильтровальной бумаги, который кладут на поверхность геля. Полоска бумаги Whatman ЗММ размером 1,5x10 мм впитывает около 10 мкл жидкости. До 2 мкл можно наносить с помощью смоченной хлопчатобумажной нитки.
Для подбора оптимального объема препарата фильтровальную бумагу можно вырезать в форме клина и наложить ее на гель так, чтобы сужение было перпендикулярно к направлению поля. Тогда каждая белковая полоса после фракционирования будет иметь интенсивность, меняющуюся вдоль ее длины, и можно будет выбрать оптимальную ширину фильтровальной бумаги для препарата, т. е. оптимальную загрузку геля. Для точной дозировки исходного количества белка на гель можно положить полоску сухой фильтровальной бумаги, а потом пипеткой нанести на нее определенный объем раствора препарата (рис. 10).
Все эти манипуляции удобно производить, ориентируясь по сетке трафарета, хорошо видной через гель. Вместо этого можно пользоваться и накладным трафаретом в виде жесткой пленки с равномерно расположенными прорезями. Впрочем, иногда при заливке геля в нем все же формируют колодцы для внесения препарата, как это делают при электрофорезе. Однако при этом не рекомендуется углубляться более чем на треть толщины геля, с тем чтобы не слишком нарушать его электропроводность.
Полоски фильтровальной бумаги обычно снимают через час после начала фокусирования. При использовании рамочек с большим объемом жидкости время ИЭФ приходится увеличивать. Следует иметь в виду возможность сорбции на фильтровальную бумагу белков из исходной смеси. Эта сорбция может зависеть от pH, поэтому не безразлично, в какой точке градиента накладывать полоску с препаратом. При отработке методики стоит попробовать 3—4 начальных положения вдоль поля. Впрочем, чаще всего сорбция происходит в кислой области, где белки заряжаются положительно, так как целлюлоза всегда несет на себе небольшой отрицательный заряд. При обычной, относительно большой начальной загрузке (50—150 мкг белка на один трек) сорбция на полоску фильтра по абсолютному значению не очень велика — примерно 1 мкг на 10 ммг. Однако она может быть избирательной в отношении белков, содержащихся в смеси в небольших количествах.
Выбор места внесения препарата в гель может диктоваться и устойчивостью белка к кислым или щелочным воздействиям. В этом случае важно обеспечить миграцию белка к его изо-электрическому положению на градиенте со стороны безопасных значений pH и соответственно выбрать место нанесения препарата на пластину. При первом ¦ фракционировании, особенно если надежных данных об устойчивости белка нет, стоит попробовать вносить препарат в несколько мест вдоль градиента pH.
В отношении скорости фокусирования белки выгоднее вносить с той стороны геля, где большая их часть сильнее заряжена (кислые белки — со стороны катода, щелочные — со стороны анода), хотя при этом и расстояние миграции может оказаться больше. Помимо уже упомянутых проблем устойчивости к кислым или щелочным воздействиям и сорбции на бумагу, следует также иметь в виду опасность агрегации белков в препарате, которая также может зависеть от pH. Надежный критерий достоверности фракционирования белков — совпадение картин фокусирования при внесении препаратов как со стороны анода, так и со стороны катода. Обратное утверждение не имеет силы: если эти картины не совпадают, то возможно, что лишь одна из них искажена за счет артефактов внесения препарата, но надо выяснить, какая именно.
Присутствие в исходном белковом препарате соли в относительно высокой концентрации (более 0,1 М) может заметно исказить градиент pH и форму полос сфокусированных белков. Этот эффект обычно выражен сильнее, когда препарат вносят с анодного конца градиента. Если в исходном препарате содержалась соль, предотвращавшая выпадение белков в осадок, то иногда оказывается возможным ее заменить на 1%-ный раствор глицина или амфолинов. Такая замена нередко сохраняет растворимость белков, не сказываясь на качестве градиента pH. Эффект обусловлен увеличением дипольного момента растворителя за счет присутствия в нем этих сильнополярных молекул. Разумеется, как и при электрофорезе, исходный препарат не должен содержать нерастворенных частиц белка. Задерживаясь в месте внесения и постепенно растворяясь, такие частицы обусловливают появление характерных «хвостов» у полос белка при фокусировании.
Наконец, белковый препарат можно вносить как с самого начала, так и после образования градиента pH в геле. При работе с лабильными белками предпочтение следует отдать второму варианту, хотя суммарная продолжительность процесса ИЭФ при этом возрастет.
Электрический режим и время ИЭФ
Как и при электрофорезе, для ускорения процесса фракционирования белков желательно использовать максимально допустимую напряженность электрического поля. Ее ограничива-
*гг возможность эффективного отвода выделяемого тепла* Приборы для горизонтального ИЭФ типа Мультифор обеспечивают мощность теплоотвода порядка 25—30 Вт. Естественно, что охлаждение тем эффективнее, чем тоньше гель. Однако работать с изготовленными в лаборатории гелями толщиной менее 1 мм затруднительно. Готовые гели выпускаются и меньшей толщины (фирма «Serva»). Заметим, кстати, что температуру охлаждающей жидкости не следует опускать ниже 2° во избежание конденсации влаги на поверхности геля.
