Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 7

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 5 6 < 7 > 8 9 10 11 12 13 .. 140 >> Следующая

1 Фирма «Bio-Rad» выпускает биолиты не только для исследовательских, но и для технических целей — менее очищенные и сбалансированные в отношении обеспечения линейности градиента pH, но зато заметно более дешевые.
1 л
Заметим попутно, что значения буферной емкости по оси ординат на рис. 5 выражены количеством микрозквивалентов сильной кислоты или щелочи, которое при внесении в 1 мл соответствующего раствора амфолитов может изменить его pH на единицу. Эти значения здесь соответствуют состоянию установившегося градиента pH, когда емкости амфолитов минимальны. Буферная емкость в 0,35 ммоль/мл для изменения pH на единицу, ^ указываемая для фармалитов в проспектах фирмы «Pharmacia», явно относится к их исходной смеси, поэтому полезной информации не содержит и носит рекламный характер.
ОПАСНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ СЛОЯ ЧИСТОЙ ВОДЫ
Желательно, чтобы амфолиты были равномерно распределены по всему градиенту pH. Особенно это важно в области нейтральных значений pH во избежание образования там слоя чистой воды. Если такой слой возникает, то в силу его малой электропроводности произойдут сильный разогрев и искажение соседних участков градиента pH за счет усиленной диффузии. Кроме того, в слое чистой воды сконцентрируется практически все напряжение источника тока, так что фокусирующий эффект градиента в целом окажется очень малым.
Описанная ситуация особенно легко может возникнуть при использовании смесей амфолитов, обеспечивающих рабочий градиент pH целиком в кислой или щелочной областях, т. е. не перекрывающий нейтральных значений pH. В этих случаях на границе градиента, в зоне перехода от амфолитов к като- или анолиту, pH неизбежно должно пройти через значение 7, так что может образоваться слой чистой воды. Ввиду этого при со-ставленин кислой или щелочной рабочей смеси амфолитов нередко добавляют в небольшой концентрации еще и амфолиты для нейтральной области pH (6—8). Они заполняют участок перехода от рабочего градиента к одному из электролитов. При этом каким-то участком рабочего объема приходится пожертвовать, но если концентрация нейтральной смеси амфолитов невелика, то и участок этот будет небольшим. В последние годы сами фирмы-производители из предосторожности стали добавлять в смеси амфолитов для кислых и щелочных диапазонов pH необходимые количества нейтральных амфолитов, не указывая этого в маркировке смеси. Тем не менее, опасности появления слоя чистой воды не следует упускать из виду, особенно если путем электрофокусирования отбирают амфолиты для более узкого, чем продажный, диапазона значений pH (см. ниже).
РАЗРЕШАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ.
ВЫБОР ДИАПАЗОНА pH
Высокая разрешающая способность метода ИЭФ уже уло-миналась выше. Независимо от способа подавления конвекции в жидкости (гель, сефадекс, сахароза), эту способность можно
количественно охарактеризовать как минималыюе различи! pi двух белков, которое еще обеспечивает четкое разделенш соответствующих зон (полос). Исходя из общих соображений можно ожидать, что разделение будет лучше в случае крупны? белков ввиду уменьшения расширения полос за счет диффузии. Кроме того, разделению двух близких по значениям р! белко! должно способствовать повышение напряженности электрического поля и уменьшение крутизны градиента pH. Чем более пологий градиент, т. е. чем меньше интервал изменения pH, перекрывающий всю длину трубки или пластины, тем дальше будут отстоять друг от друга полосы белков, незначительно отличающихся по величине pi, тем лучше «разрешение». Впрочем, не следует забывать, что за это приходится «расплачиваться» увеличением длительности процесса ИЭФ. При пологом градиенте pH белки заряжены слабее и движутся к положению равновесия медленнее. Правильность этих предположений подтверждают как строгая теория ИЭФ, так и практика.
Наряду со смесью амфолитов, обеспечивающей формирование градиента pH на весь биохимически интересный диапазон (pH 2,5—10), с целью более тонкого разделения белковых полос фирмы выпускают и смеси амфолитов для относительно узких (шириной в 1,5—3 единицы), перекрывающихся между собой интервалов pH (2,5—4; 3,5—5; 4—6; 5—8 и т. д.). Смеси серва-литов в интервале pH 4—5,5 выпускаются даже для долей этого интервала шириной всего в 0,5 ед. pH. Следует иметь в виду, что эти интервалы указываются для ИЭФ в градиенте сахарозы. При использовании амфолитов для ИЭФ в геле какая-то доля щелочного участка указанного в маркировке интервала pH за счет эндосмоса неизбежно уходит из геля к катоду, поэтому следует готовить и использовать смеси продажных амфолитов, как это будет рекомендовано ниже.
Амфолиты, обеспечивающие широкий интервал pH, удобны для исследования сложных смесей белков с неизвестными значениями pi, тогда как амфолиты с узким интервалом — для тонкого фракционирования белков с близкими и приблизительно известными значениями pi. Амфолиты выпускаются в продажу в виде концентрированных 30- или 40%-ных стерильных водных растворов, а наиболее кислые или щелочные смеси ввиду их повышенной электропроводности — чаще в виде 20%-ных растворов. При составлении рабочих градиентов pH и#,, .разбавляют до оптимальной концентрации (1—2%).
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 5 6 < 7 > 8 9 10 11 12 13 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed