Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Рассмотрим для примера миграцию амфолитов в направлении катода. Быстрее других будут двигаться амфолиты с максимальным значением рI, так как при исходном pH они несут наибольший положительный заряд. Чтобы избежать их выхода из рабочей зоны градиента и попадания на сам катод, последний помещают в слабый раствор щелочи. При подходе к щелочи положительный заряд амфолитов с наибольшим значением pi нейтрализуется, поэтому они останавливаются. Там же, вблизи катода первоначально будут находиться и амфолиты с меньшими значениями pi. Однако по мере повышения в этой зоне содержания амфолитов с максимальным pi исходная эквимо-лярная пропорция будет нарушаться в пользу последних. Они будут «навязывать» раствору локальный сдвиг pH в щелочную сторону. Это ускорит уход отрицательно заряженных амфолитов с меньшим pi из катодной зоны, что приведет к дальнейшей диспропорции в пользу амфолитов с максимальным pi, дальнейшему защелачиванию раствора. Это будет происходить до тех пор, пока из прилежащей к катоду области градиента не будут вытеснены все прочие амфолиты и она не окажется занятой только молекулами амфолита с максимальным значением pi. Соответственно и pH раствора в этом месте окажется равным этому же значению. Постепенно в эту прикатодную область соберутся амфолиты с максимальным pi из всего объема жидкости; только они и смогут ее достигнуть. Для амфолитов с меньшими значениями pi катодная область градиента недоступна — в ней они приобрели бы отрицательный заряд и должны были бы под действием поля ее покинуть. По тому же механизму конкурентного вытеснения эти амфолиты расположатся в непосредственном соседстве с катодной областью, оттесняя
еще дальше амфолиты со следующим, меньшим значением р!, и т. д.
В это же время аналогичная «борьба» за место поближе к аноду будет происходить под действием поля с противоположного конца трубки или пластины. Здесь крайнее положение останется за амфолитами с наименьшим значением pi, которые первоначально имели наибольший отрицательный заряд. От выхода к аноду их там удерживает слабый раствор кислоты.
Заметим попутно, что во избежание существенного искажения формы градиента на его концах pH катодного (католита) и анодного (анолита) электролитов не должны слишком сильно отличаться от значений pH по краям градиента.
В результате описанного процесса все амфолиты «выстраиваются» вдоль электрического поля от анода к катоду в порядке возрастания значений pi. Все они при этом нейтрализуются, «навязывают» тому объему воды, в котором они преобладают, значение pH равное их pi, и обеспечивают буферную емкость раствора в этом месте, т. е. ведут себя точно так, как им свойственно при растворении в воде в отсутствие других амфолитов.
Описанную «сортировку» амфолитов производит электрическое поле; такое положение сохраняется до тех пор, пока это поле существует. В результате диффузии и близости значений pi соседних амфолитов (из-за их многочисленности) границы между зонами сглаживаются и получается практически линейный градиент pH (рис* 3). На рисунке для сравнения изображены градиенты для трех диапазонов pH. Резкие падения и подъемы кривых на концах графиков указывают области перехода от амфолитов к электродным электролитам.
ПРОБЛЕМА ЭЛЕКТРОПРОВОДНОСТИ
Естественное недоумение может вызвать вопрос о поддержании электрического тока в установившемся градиенте pH. Выше упоминалось, что «расставленные по своим местам» амфолиты утрачивают заряд. Отсюда будто бы следует, что они не могут участвовать в проведении электрического тока. Но других носителей тока практически нет. Между тем, для обеспечения миграции белков вдоль градиента pH и для поддержания самого градиента необходимо наличие электрического поля, а следовательно, и электрического тока — жидкость должна оставаться электропроводящей. На практике можно наблюдать, что в процессе формирования градиента pH электропроводность раствора действительно сильно снижается, но отнюдь не до нуля. Чем же обусловлена остающаяся электропроводность?
Чтобы ответить на этот вопрос, необходимо дополнить и уточнить картину состояния амфолитов в растворе при рН = = pi. Выше было сказано, что они при этом не заряжены, Собственно говоря, именно это обстоятельство определяет изоэлек-
pH
Рис. з. Линейные градиенты pH для амфо литов трех диапазонов
/ — pH 3—6; 2 — pH 5-8; 3 — pH 7—10; — рас
9
стояние вдоль градиента
7
трическую точку. Тем не менее, деле обстоит не совсем так. Точнее было бы сказать, что суммарный заряд всех молекул амфолита при рН=р! равен нулю, причем не только за счет молекул, действительно электрически нейтральных, которых подавляющее большинство, но и за
5
3
О го 40 SO 80 100 l,Hh
счет некоторого (и одинакового) числа ионов того и другого знака.
Поясним их происхождение на уже рассмотренном примере раствора глутаминовой кислоты. Мы там сознательно избегали категорических утверждений. Было сказано, что в растворе при pH 3,22 преобладает изображенная там структура и что вторая карбоксильная группа остается преимущественно недиссощшро-ванной, так как для нее раствор с pH 3,22 представляет собой кислую среду. Но ведь не очень кислую! При рН=р/Сг==4,25 50% карбоксильных групп в ^-положении было бы диссоциировано. При pH 3,22 число диссоциированных 7-карбоксилов невелико, но все еще заметно, и часть молекул глутаминовой кислоты в растворе находится в виде отрицательных ионов:
