Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 12

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 6 7 8 9 10 11 < 12 > 13 14 15 16 17 18 .. 140 >> Следующая

Отметим также, что NP-40 образует комплексы с самими амфолинами, которые выпадают в осадок при фиксации белков ТХУ. Гель при этом мутнеет; его надо длительное время отмывать 10%-ным раствором ТХУ в 30%-ном этаноле до полной прозрачности и лишь затем окрашивать в нем белки.
Растворения некоторых мембранных белков в неденатуриро-ванном состоянии удается добиться только с помощью высоких (до 10%) концентраций Тритона Х-ЮО. При фокусировании его же вносят в состав геля. Банга и соавторы указывают на то, что для успешного фокусирования в этом случае необходимо принимать особые меры по деионизации всех жидкостей, начиная от самой суспензии мембран и маточного раствора детергента и кончая смесью мономеров геля перед его полимеризацией [Banga et al., 1978].
Для растворения некоторых мембранных белков упомянутых средств оказывается недостаточно. Ионные детергенты типа ДДС-Na или цетавлона непригодны — электрическое поле уведет их из геля. В этих случаях может помочь использование цвиттерионных детергентов, выпускаемых фирмой «Calbiochem» под общим названием «Zwittergent». Описано, например, растворение цитохрома Р-450 из эндоплазматического ретикулума печени мыши с помощью 1%-ного раствора Тритона Х-100, содержащего 1% Zwittergent 3-14 (это цвиттерион вида (СН3)2-¦ (C14H2e) N+(CHj,)3S03“; в цитируемой работе он обозначен SBU). В состав ПААГ для фокусирования в диапазоне pH 7—
11 тоже вносили по 0,05% обоих детергентов. Меньшая их концентрация в геле или использование только одного из них не обеспечивают сохранения белка в растворе. Есть предположение, что Тритон Х-100 и Zwittergent 3-14 образуют смешанные мицеллы особой формы, обусловливающей их повышенное со-
О*
люоилизирующее действие [Hielmeland et alM 1979]. Отметим, что при ИЭФ белков, особенно склонных к окислению, в гель можно ввести 1 мМ дитиотреитола.
Подготовка пластин и прибора
Подготовка и сборка формы для пластины геля, деаэрация смеси мономеров акриламида и амфолитов, добавление персульфата аммония, заливка в форму, полимеризация и извлечение геля из формы —все эти операции производят точно так же, как при электрофорезе в горизонтальных пластинах ПААГ» за исключением того, что из-за высокой вязкости раствора, содержащего глицерин, деаэрацию следует вести дольше — около 10 мин. Необходимо напомнить, что мономеры акриламида очень токсичны, поэтому надо избегать их попадания на кожу и в дыхательные пути*
Стандартная форма фирмы «LKB» предназначена для получения пластин ПААГ размером 10x25 см и толщиной 2 мм. Ее резиновую прокладку слегка смазывают силиконовой смазкой. Готовый для помещения в прибор гель располагается на тонкой стеклянной пластине. В таком виде его устанавливают на охлаждающий столик прибора Мультифор, Перед работой полезно дать гелю «состариться» (завершить полимеризацию в течение ночи на холоду), обернув его полиэтиленовой пленкой во избежание обсыхания. Гели со щелочными амфолитами хранить дольше не следует — они не очень устойчивы. Нейтральные и кислые гели можно хранить во влажной камере и на холоду в течение нескольких дней.
Для приготовления гелей толщиной 0,8 и 1,6 мм фирма «Bio-Rad» предлагает новый простой способ, основанный на использовании капиллярных сил. Стеклянную пластинку через боковые прокладки накладывают на горизонтально расположенную подложку из полиакрилата. Смесь мономеров и амфолитов из пипетки вносят в зазор между пластинкой и подложкой. Капиллярные силы втягивают жидкость до тех лор, пока она не заполнит весь свободный объем под пластинкой. Уплотнений при этом не требуется. По окончании полимеризации гель легко отрывается от подложки — его можно поднять вместе со стеклянной пластинкой. Дело здесь в полиакрилате — он хорошо смачивается, но застывший гель к нему не прилипает.
Описано также ИЭФ в ультратонких гелях (0,12 и 0,24 мм). Полимеризацию ведут в стеклянной форме с прокладками из одного или двух слоев парафильма. Одно из стекол формы покрывают смоченным целлофаном, на котором гель впоследствии переносят на столик прибора Мультифор (для улучшения теплоотвода), а затем и в ванночку для окрашивания. Заливают форму заранее рассчитанным объемом смеси мономеров через тонкую иглу шприца, слегка раздвинув пластинки формы сверху. После заливки их снова сжимают и жидкость заполняет
весь объем формы. Благодаря эффективному охлаждению тонкой пластины геля имеется возможность проводить ИЭФ при высокой напряженности электрического поля, что позволяет получить узкие полосы белка [Gorg et al„ 1978].
Преимущества ультратонких ПААГ для ИЭФ столь существенны, что в разработку методов их приготовления включаются и ведущие фирмы. «Pharmacia» предлагает метод, основанный на применении выпускаемого фирмой реактива Silane AI74 (7-метакрилоксипропилтриметоксисилана). Обработка стекла этим реактивом присоединяет активные винильные группы к его поверхности. ПААГ, полимеризованный на таком стекле, связывается с ним прочной химической связью. Обработка реактивом проста — достаточно вымачивать хорошо очищенное стекло в течение часа в 0,4%-ном свежеприготовленном водном растворе Silane А174, подкисленном до pH 3,5 уксусной кислотой. Для приготовления ультратонкого геля по краям вдоль больших сторон обычного стекла размером 230x115 мм наклеивают одну или несколько полосок водоотталкивающей липкой ленты толщиной 0,05 мм. Этим задается толщина будущей пластины геля. Смесь мономеров акриламида вносят между полосками с одного узкого края стекла. Затем, начиная с этого же края, осторожно накладывают вторую стеклянную пластину такого же размера, обработанную Silane А174 (следить за отсутствием воздушных пузырей!). Слегка сжимают стекло зажимами; герметизация не нужна. После окончания полимеризации верхнюю пластину с прочно приставшим к ней ровным ультра-тонким слоем ПААГ можно просто поднять.
Предыдущая << 1 .. 6 7 8 9 10 11 < 12 > 13 14 15 16 17 18 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed