Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Токсичностью по отношению к белкам амфолины не обла дают. По-видимому, никаких комплексов с белками они не об разуют.
эндосмос
Это явление характерно для всех процессов фракционирования молекул в гелях под действием электрического поля, в том числе и для ИЭФ. Суть его заключается в том, что с неподвижной матрицей геля всегда связано некоторое количество заряженных (чаще всего отрицательно — остатки кислот) ионогенных групп. Их соответствующие противоионы (катионы) находятся в растворе. Под действием электрического поля они мигрируют к катоду, понемногу увлекая за собой и жидкость, находящуюся внутри геля. На смену им приходят катионы из анодного электролита. Вместе с жидкостью в направлении катода «дрейфует» и весь градиент pH, постепенно выходя из объема трубки или пластины. Ввиду длительности процессов ИЭФ этот «катодный дрейф» может существенно сместить картину распределения белков, а некоторые ближайшие к катоду полосы могут быть и вовсе утрачены. Кроме того, наиболее крупные, медленно мигрирующие молекулы белков могут не успевать следовать за смещением градиента, так что их полосы будут размазываться. Явление эндосмоса сильнее выражено в щелочной области pH, где в полной мере проявляют себя связанные с матрицей отрицательные заряды.
Заметим еще, что для ИЭФ, особенно после установления градиента pH и соответственного снижения электропроводности, характерны более высокие значения напряженности электрического поля, чем для электрофореза. Между тем, явления эндосмоса выражены тем сильнее, чем выше напряженность поля. Следует также иметь в виду, что эта напряженность вследствие различия электропроводности разных амфолитов (см. выше) оказывается неодинаковой в разных участках градиента. Отсюда следует, что и течение жидкости в результате эндосмоса будет неравномерным вдоль градиента. Из областей повышенной напряженности поля жидкость будет вытекать быстрее, чем поступать в них из соседних областей, где напряженность поля ниже и эндосмос выражен слабее. Это может привести к обсыханию некоторых областей геля и переполнению других. Обсыхание влечет за собой дальнейшее увеличение сопротивления, напряженности поля и эндосмоса. В конечном счете могут развиться существенные искажения градиента pH,
Ввиду изложенного, забота о снижении эндосмоса — важный момент проведения ИЭФ белков. В первую очередь, это накладывает определенные ограничения на используемые для образования гелей материалы, как это более подробно рассмот^ рено ниже.
Глава 2
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ ИЭФ
ИЭФ В ГОРИЗОНТАЛЬНЫХ ПЛАСТИНАХ ПААГ
Преимущества использования для ИЭФ тонких горизонталь ных пластин геля столь очевидны, что достаточно их перечислить без всяких комментариев. Вот важнейшие из них.
1* Препарат можно вносить в любое место открытой поверхности геля.
2. Можно одновременно вести ИЭФ многих препаратов е ^идентичных условиях.
3. Лабильные белки можно вносить в любой участок градиента pH уже после его формирования.
4. Интенсивный и равномерный теплоотвод*
5. Можно измерять pH и напряженность поля непосредственно на поверхности геля.
6. Удобство фиксации, окраски, фотографирования и авторадиографии материала в геле.
Для ИЭФ в этом случае используют те же приборы, что и для электрофореза в горизонтальных гелях — «Мультифор» (LKB-2117) и другие аналогичные конструкции («Desaphor», «Bio-Rad 1415», «Pharmacia FBE-ЗООО» и др.). Аналитическое фокусирование обычно ведут в направлении меньшего размера охлаждающего столика на длине 10—12 см одновременно для многих препаратов. В случае полупрепаративного ИЭФ с его большей загрузкой и относительно широкими полосами разделение белков проводят в направлении большего размера столика на длине 26 и даже 40 см.
В отличие от электрофореза объемы электродных буферов (электролитов) при ИЭФ желательно свести до минимума. С одной стороны, опасность изменения pH электролитов в результате электролиза из-за небольшой силы тока невелика. С другой стороны, возникновение конвекционных токов жидкости в объемах электродных резервуаров может вызвать нарушение установившихся градиентов pH между электродами и гелем. Поэтому при ИЭФ в горизонтальных гелях объем электродного «резервуара» сводится к объему жидкости, смачивающей одну или несколько полосок фильтровальной бумаги. Эти полоски накладывают прямо на поверхность геля, и к ним прижимают по всей длине платиновую проволоку или угольный электрод.
ПААГ для ИЭФ
Приготовление смеси мономеров акриламида производят точно так же, как для электрофореза. Те же соображения и рекомендации остаются в силе для подбора концентраций инициирующих добавок — персульфата аммония или рибофлавина.
Вносить в смесь ТЕМЭД нет необходимости, так как амфолиты сами играют роль катализаторов полимеризации.
Следует избегать внесения избытка персульфата аммония. Он может окислять амфолиты, а также вносить искажения в градиент pH. Особенно сильные искажения могут наблюдаться вблизи анодного конца градиента, где концентрируются отрицательные ионы персульфата. Как и при электрофорезе, остающиеся в геле стабильные свободные радикалы персульфата способны окислять белки. В тех случаях, когда угроза окисления белков представляется серьезной, следует провести предварительное фокусирование амфолитов в геле без препарата в течение 2—3 ч. За это время отрицательно заряженные радика-лы успеют покинуть гель и уйти к аноду. Однако часть радикалов персульфата останется в геле из-за существования их незаряженной формы. Для их нейтрализации можно до внесения белкового препарата «прогнать» через весь градиент pH от его катодного к анодному концу тиогликолевую кислоту в количестве, эквимолярном внесенному персульфату, как это иногда делают и перед электрофорезом. Нередко вместо этого прямо в гель перед его полимеризацией добавляют дитиотреитол до концентрации 1 мМ.
