Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
При замене персульфата на рибофлавин следует иметь в виду, что такая замена возможна только для первоначального значения pH смеси амфолитов ниже 7,5. В щелочной области pH рибофлавин в качестве инициатора полимеризации неэффективен.
Уже упоминалось, что ИЭФ удобно вести в крупнопористом ПААГ, например 5%-ном (Г=5; С — 3). Для его полимеризации достаточно ввести персульфат аммония в концентрации 0,025%. Особенно высокие требования при ИЭФ приходится предъявлять к чистоте акриламида. Важно уменьшить содержание в нем акриловой кислоты, приводящей к возникновению эндосмоса. Если нет уверенности в чистоте продажного препарата, его следует перекристаллизовать или лучше обработать уже в виде маточного раствора смеси мономеров 1—2%-ной суспензией бифункциональной ионообменной смолы типа «АтЬегШе МВ-1» или «AG501X8».
Для подавления остаточных явлений эндосмоса имеет смысл увеличить вязкость жидкой среды в геле, введя в нее до 10% глицерина. Иногда для этой цели используют сахарозу или сорбит, но глицерин, как правило, чище; к тому же его можно легко перегнать. Увеличение вязкости не слишком сильно замедляет электрофоретическую миграцию белков, но очень существенно уменьшает степень увлечения жидкой среды движущимися к катоду противоионами, т. е. степень катодного дрейфа градиента pH.
Выбирая амфолиты для смеси, следует иметь в виду не только желательный градиент значений pH, но и переходы от него к электпплам. с тем чтобы не допускать образования слоя чис-
той воды и смягчить резкие скачки pH от амфолитов к кислот* или щелочи. Об образовании слоя воды и мерах предупреждения этого явления было сказано выше. Резкие переходы pH от рабочего градиента к электролитам электродов приводят к за-кислению или защелачиванию заметного участка на соответствующем конце градиента и к оттеснению амфолитов внутрь рабочего объема геля.
Во избежание этого для образования градиента, например в области pH 2,5—4,2, фирма «LKB» рекомендует смешать амфолины диапазонов pH 2,5—4, 3,5—5 и 4—6 в пропорции 6:3:1 так, чтобы суммарный их объем составил 1/гя полного объема геля. Указанное соотношение основной и вспомогательных смесей амфолинов фирма рекомендует и в других случаях. Для большинства смесей при этом получается 2%-ная конечная концентрация амфолинов в растворе, поскольку они поставляются в виде 40%-ных растворов. Для смесей с участием амфолинов Для диапазонов pH 2,5—4 и pH 9—11 конечная концентрация будет ниже, так как эти амфолины ввиду их повышенной электропроводности выпускаются в виде 20%-ных растворов.
Однако концентрацию амфолитов нельзя снижать слишком сильно. Во всяком случае, она должна быть больше 1%, иначе возникнут локальные участки разогрева геля. По-видимому, это происходит из-за недостаточного перекрывания соседних зон амфолитов между собой. Кроме того, при недостаточной концентрации амфолитов градиент оказывается нелинейным, а это приводит к заметному сдвигу картины распределения белковых полос.
В качестве катодного электролита для градиента, лежащего целиком в кислой области pH, лучше использовать не щелочь, а 2%-ный раствор амфолинов диапазона pH 6—8. Анодным электролитом может служить I М раствор Н3Р04. Для градиента в щелочной области pH (7,8—10) та же фирма рекомендует смесь амфолинов диапазонов pH 7—9 и pH 9—11 в пропорции
I : 4. В этом случае 2%-ный раствор амфолинов pH 6—8 рекомендуется использовать в качестве анодного электролита, а катод следует поместить в 1 М NaOH. Диапазон pH 4,5—7 можно обеспечить, смешав 2%-ные растворы амфолинов pH 5—7 и pH 7—9 в соотношении 3:1; при этом в качестве электродных электролитов следует использовать I М NaOH и 1 М Н3Р04. Такие же электролиты используют при работе с широким диапазоном pH (3,5—10).
Можно заметить, что во всех трех рассмотренных примерах фирма «LKB» рекомендует использовать смеси амфолинов, выходящие по своему составу за пределы желаемого диапазона pH, причем именно в сторону щелочных его значений. Это связано с эндосмосом, который полностью подавить не удается. Наиболее щелочная область смеси амфолинов, как уже упоминалось, в ходе ИЭФ покинет гель и уйдет к катоду.
Напомним, что смеси амфолитов для разных интервалов pH можно комбинировать для улучшения линейности градиента или, наоборот, для введения в него пологого участка с целью более тонкого фракционирования части белков смеси. Общее правило здесь таково: увеличение относительного содержания
амфолитов определенного узкого диапазона pH приводит к расширению занимаемой ими области на градиенте и, следовательно, к более пологому ходу его и а этом участке.
Можно также обратить внимание на довольно высокие значения концентрации кислоты и щелочи, используемых в качестве электролитов. Они диктуются незначительностью их объемов (жидкость, смачивающая полоски фильтровальной бумаги, подложенные под электроды по краям геля). Опасности денатурации белков это не создает из-за возможности нанесения исходного препарата на горизонтальную пластину в достаточном удалении от электрода (другая ситуация складывается при ИЭФ в трубках). Вместе с тем, имеется опасность захвата щелочью углекислого из воздуха, образования угольной кислоты и
