Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Фирма «LKB» выпускает для ИЭФ в приборе Мультифор уже готовые пластины ПААГ того же размера (но толщиной
1 мм) под названием «LKB 1804 Ampholine PAG plate» на следующие диапазоны pH: 3,5—9,5; 4—5; 4—6,5 и 5,5—8,5. Пластины представляют собой 5%-ный ПААГ, сшитый 0,15% бисакри-ламида и содержащий по 2,4% амфолинов соответствующего диапазона. Гель сформирован на прозрачном пластике толщиной менее 0,1 мм, что существенно улучшает условия теплоотвода во время ИЭФ. Каждая пластина герметически запечатана в прозрачную пленку. Перед началом опыта упаковку обрезают по краям, кладут пластину на столик прибора и снимают защитную пленку. После этого пластинка готова к наложению на нее электродов и внесению препаратов. В случае необходимости фокусирования малого числа препаратов часть пластинки можно просто отрезать ножницами и сохранить.
Фирма «Serva» продает готовые пластины для диапазонов pH 3—10, 4—5 и 7—8 под общим названием «Servalyt precotes». 5%-ный ПААГ в них содержит соответствующую смесь амфолитов в суммарной концентрации 3% с добавлением до 10% сорбита. Кроме того, эта же фирма предлагает полиэфирные пленки толщиной 0,18 мм для полимеризации на них акрила-мидного геля или агарозы («Gel-Fix sheets»). Пленки, предназ-
Рис. 7. Укладка трафарета с сеткой на охлаждающий столик прибора «Мультифор»
Рис, 8. Укладка стеклянной пластины с гелем на трафарет
Рис. 9- Наложение па гель электродной полоски фильтровальной бумаги
наченные для ПААГ, покрыты тончайшим слоем ковалентно связанного с ними акриламида, а пленки для агарозы точно так же обработаны агарозой. Благодаря этому в лабораторных условиях соответствующие гели прочно связываются с пленками. Выпускаются и силиконированные полиэфирные пленки, не прилипающие к гелям и полезные для их сохранения во влажном виде.
Перед установкой на столик прибора готовой пластинки ПААГ или геля, полимеризованного на стеклянной пластинке в лаборатории, под них подкладывают специальный трафарет с сеткой, которую достаточно хорошо видно через гель (рис. 7). Это удобно как для параллельного расположения полосок фильтровальной бумаги, на которые накладывают электроды, так и для нанесения препаратов на поверхность геля, как описано ниже. Между трафаретом и охлаждающим столиком, а также между стеклом, на котором полимеризован гель, и трафаретом должен быть обеспечен надежный контакт для эффективного теплоотвода. С этой целью на поверхность, расположенную внизу, наливают немного керосина или парафинового
масла, а верхнюю поверхность (трафарет или пластинку) начинают накладывать с одного конца, так чтобы жидкость между поверхностями ложилась сплошным слоем без воздушных пузырей (рис. 8).
Так же внимательно надо следить и за отсутствием воздушных пузырей между электродными полосками фильтровальной бумаги и поверхностью геля. Полоски шириной 1 см накладывают прямо на гель, по краям его, параллельно друг другу, по трафарету (рис. 9). Пропитывающая их жидкость служит электродным электролитом (см. выше). Бумага должна быть хорошо увлажнен а, но без излишков жидкости на ее поверхности. Следует избегать и задержания пузырьков воздуха в толще самой бумаги. Для этой цели бумагу можно смачивать, например* следующим образом: сухую полоску положить на стекло и пипеткой вносить дозированное количество жидкости сбоку в за-зор между бумагой и стеклом, замачивая, таким образом, бумагу снизу.
Платиновые электроды прижимают к полоскам влажной бумаги по всей длине разного рода специальными приспособлениями, обеспечивающими их равномерный контакт. В приборе Мультифор этой цели служит прозрачная крышка, по краям которой вмонтированы платиновые проволоки. Крышка одновременно предохраняет гель от высыхания. Прибор комплектуется двумя типами крышек (с электродами, расположенными вдоль длинных или коротких сторон геля), ИЭФ в узком щелочном интервале pH ввиду значительного эндосмоса может приводить к перенасыщению катодной полоски фильтровальной бумаги и выступанию влаги на ее поверхности. Эту влагу надо время от времени удалять кусочком сухой фильтровальной бумаги.
Внесение препарата
ИЭФ в горизонтальной пластине, как и электрофорез, ведут одновременно для многих образцов в параллельных треках. При этом нет необходимости вносить исходные препараты равномерно по сечению пластины, например в колодцы, как это делают при электрофорезе. Можно примириться с тем, что белки будут постепенно диффундировать с поверхности геля в глубину. Фокусирование белков идет из любого первоначального объема и достаточно долго. За это время диффузия в поперечном направлении успеет выравнять концентрацию белка по толщине пластины.
Препарат в небольшом объеме жидкости (10—15 мкл) можно наносить в виде капли или полоски непосредственно на поверхность геля. Концентрация белка в препарате обычно должна составлять 5—10 мг/мл. Таким образом, обычная загрузка каждого трека — 50—150 мкг белка. Для больших объемов жидкости к поверхности геля слегка прижимают рамочку из плексигласа, куда можно залить до 0,15 мл препарата. Иногда
