Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 19

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 13 14 15 16 17 18 < 19 > 20 21 22 23 24 25 .. 140 >> Следующая

Выбор знака верхнего электрода связан с тем, что белковый препарат вносят на гель сверху. При этом следует учесть как соображения устойчивости белка при кислых или щелочных значениях pH амфолитов, располагающихся по концам градиента, так и желательность максимального начального заряда белка для увеличения скорости его миграции в геле. Степень устойчивости белка к экстремальным значениям pH может диктовать и момент внесения препарата. Если белок вносят после предварительного фокусирования амфолитов, то он быстрее достигнет своего равновесного положения. Это может иметь первостепенное значение для сохранения биологической активности, если только миграция через область pH конца градиента не представляет для данного белка опасности. В противном случае белковый препарат приходится наносить на гель до начала ИЭФ, когда смесь амфолитов еще имеет среднее значение pH.
Разбавленные белковые растворы можно наносить на гель порциями, одну за другой. О завершении перехода белков в гель можно ориентировочно судить по проникновению в него следовых количеств красителя бромфенолового синего, который в этом случае подмешивают к препарату (если его вносят с катодного конца градиента). Количество белка берут обычно из расчета 1—10 мкг на сфокусированную зону. Такое количество надежно обнаруживается окрашиванием. Если далее предполагают фракционировать белки во втором направлении, то загрузку следует увеличить. Ее предельная величина зависит от растворимости белка в изоэлектрической точке. О способах ее увеличения сказано ниже. Для ориентировки можно считать, что 50 мкг белка в полосе — верхний предел загрузки ПААГ при ИЭФ в трубках диаметром 3 мм.
Для выбора рабочего режима, не приводящего к перегреванию геля, можно исходить из ориентировочного значения 0,25 Вт рассеиваемой тепловой мощности для стеклянной трубки длиной 10 см и диаметром 3 мм при толщине стенок 1,5 мм и охлаждении циркулирующей жидкостью с температурой 4°. Это означает, что максимально допустимый начальный ток должен составлять примерно 0,5 мА на трубку вплоть до того момента
(через 30—60 мин), когда для поддержания этого тока потребуется напряжение около 500 В, после чего дальнейшее увеличение напряжения лучше приостановить и примириться с некоторым снижением силы тока. Примеры выбора условий и режимов ИЭФ в трубках будут приведены ниже при подробном анализе метода двумерного фракционирования белков, предложенного О'Фарреллом, где ИЭФ используется в первом направлении.
Для измерения истинного распределения pH вдоль градиента в цилиндрике геля, извлеченном из трубки, приходится раз* резать гель на короткие участки одинаковой длины и элюировать амфолиты из них водой или (лучше) 0,01 М раствором хлористого калия. Во избежание чрезмерного разбавления амфоли* тов объем элюата не должен более чем в 5 раз превышать объем геля. При этом следует избегать закисления раствора в щелочной области градиента за счет поглощения углекислого газа из атмосферы, для чего необходимо измерять pH немедленно после элюции, а элюирующую жидкость предварительно прокипятить. Можно пользоваться и торцевыми электродами для измерения pH непосредственно в геле после его извлечения из трубки.
Для окрашивания белков в цилиндриках геля используют те же приемы, что и для пластин. Окрашенные гели иногда ден-ситометрируют с помощью сканирующих устройств, которыми оборудованы многие современные спектрофотометры. Об ограничениях метода денситометрирования окрашенных белковых полос для оценки содержания в них белков подробно сказано в первой книге [Остерман, 19811.
В качестве иллюстрации использования метода ИЭФ в трубках процитируем недавнюю работу по разделению и определению pi гистонов печени быка [Valkonen, Piha, 1980].
Гистоны извлекали из очищенных ядер 0,2 н, раствором H2SO+. Трубки диаметром 5 мм и длиной 24 см перед заливкой продували азотом, В смесь мономеров, содержавшую 5% акриламида, 0,16% метиленбисакриламида, 0,4% ТЕМЭД и 0,033% персульфата аммония в 6,25 М растворе мочевины, добавляли амфолины {«LKB») диапазонов pH 9—11 (0,9%) и 3—10 (0,2%). После
обычной деаэрации перед внесением персульфата через смесь продували азот, Анолит (0,025 М Н3РО4) и католит (0,05 М NaOH) также деаэрировали перед использованием. ИЭФ вели в приборе марки «Shandon SAE-2734» с охлаждением циркулирующей водой при 4°, В течение двух часов проводили предфо-кусирование при токе 0,5 мА на трубку, затем наносили на каждую трубку по 100—500 мкг суммарного препарата гистонов в 50—500 мкл 6,25 М раствора мочевины. Начальная сила тока составляла 1 мА на трубку. Фокусирование вели в режиме постоянной мощности с ограничением напряжения до 400 В. Равновесие достигалось через 20 ч. Градиент pH после извлечения геля изме-ряли через каждые 0,5 см торцевыми электродами в атмосфере азота. Фиксировали белки и вымывали амфолины пятью сменами 30%-ного раствора TXY, Окрашивали гель 0,05%-ным раствором СВВ R-250 в 20%-ном водном растворе ТХУ с 5% сульфосалициловой кислоты* Отмывали гель в 10%-ном растворе уксусной кислоты* содержащем 10% изопропанола.
Предыдущая << 1 .. 13 14 15 16 17 18 < 19 > 20 21 22 23 24 25 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed