Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Здесь не имеет смысла описывать приемы авторадиографии и флюорографии, элюции и счета радиоактивности, используемые при ИЭФ радиоактивных белков в гелях, поскольку эти вопросы подробно рассмотрены в части III. Упомянем и о возможности сочетания ИЭФ с иммунохимическими подходами, подробно рассмотренными в части II.
ИЭФ В ТРУБКАХ ПААГ
Этот вариант ИЭФ в последнее время применяется главным образом для фракционирования белков в первом направлении при двумерном их разделении, однако его можно использовать и самостоятельно. Для улучшения охлаждения ИЭФ проводят в трубках с внутренним диаметром 2,5—3 мм и длиной 10— 20 см. Равномерность и эффективность теплоотвода здесь настолько существенны, что следует применять охлаждение трубок жидкостью с принудительной ее циркуляцией. При этом для обеспечения стабильности переходной зоны pH между границей геля и электродами стараются по возможности уменьшить объемы электродных резервуаров и максимально приблизить электроды к торцам геля. Описана специальная конструкция прибора для этой цели [Righetti, Drysdale, 1971]. Впрочем, в большинстве случаев вполне удовлетворительные результаты могут быть получены и в обычных приборах для электрофореза в вертикальных трубках с жидкостным охлаждением, например «Bio-Rad 155». Требования к чистоте трубок при ИЭФ еще более высоки, чем при электрофорезе.
Соображения, касающиеся состава геля, концентрации и пропорций амфолитов, остаются здесь теми же, что и для горизонтальных пластин ПААГ. Отметим, однако, что опасность эндо-
смоса при ИЭФ в трубках обусловлена не только присутствием остатков акриловой кислоты в ПААГ, но и наличием поверхностных зарядов на стекле. Для уменьшения эндосмоса внутреннюю поверхность стеклянных трубок силиконируют. Можно использовать и трубки из плексигласа или других прозрачных пластмасс, не создающие дополнительного эндосмоса, хотя условия теплопередачи при этом несколько ухудшаются. ПААГ хуже связывается с силиконированной поверхностью стекла или пластмассой, чем с чистым стеклом, однако при ИЭФ это менее существенно, чем при электрофорезе. Белки нередко фокусируй ются в виде периферических колец, а не дисков, и становятся тем самым даже более доступными для окрашивания и тестирования по биологической активности. Кроме того, облегчается задача извлечения тонких столбиков геля — для этого часто бывает достаточно напора воздуха с одного из концов трубки.
Заполнение трубок смесью мономеров акриламида, амфолитов и глицерина удобно осуществлять с помощью пастеровской пипетки, подавая эту смесь под небольшим давлением от надетой на пипетку резиновой «груши». При этом ввиду того, что раствор довольно вязок, а диаметр трубки — мал, следует особенно внимательно следить за отсутствием воздушных пузырей. Сначала выдавливают остатки воздуха из кончика пипетки, потом опускают его до закрытого парафильмом дна трубки и по мере ее заполнения поднимают кончик пипетки так, чтобы он все время оставался под поверхностью жидкости. Затем на смесь осторожно наслаивают воду или изобутанол и оставляют ее полимеризоваться. Впрочем, форма торцевой поверхности геля при ИЭФ не играет такой важной роли, как при электрофорезе.
При ИЭФ в пластинах ПААГ и трубках существенно должны различаться способы внесения препарата, поскольку в трубке его уже нельзя нанести на любой участок геля (и градиента pH). Здесь остаются только две возможности: либо вносить
белковый препарат в весь объем смеси мономеров до их полимеризации, либо наслаивать его на торец геля в непосредственном соседстве с электродными электролитами. Первый вариант не всегда выгоден, особенно для малых объемов препарата. Кроме того, в этом случае неизбежно имеет место взаимодействие белка с радикалами персульфата аммония, а также воздействие на него повышенной температуры в процессе полимеризации геля. В большинстве случаев белковый препарат вносят на торец геля в объеме 10—50 мкл раствора амфолитов с добавлением в него примерно 10% глицерина или сахарозы. Белки, как правило, следует оберегать от непосредственного контакта с электродными электролитами. Для этого рекомендуется после сборки прибора и заливки в верхний резервуар электролита вытеснить его из верхней части каждой трубки раствором амфолитов, а уже затем под него подслаивать растворы исходных препаратов.
При ИЭФ в трубках концентрацию электролитов (NaOH и Н3Р04) можно снизить до 10—20 мМ, т. е. уменьшить в 50— 100 раз по сравнению с той, которую используют для горизонтальных пластин, поскольку объем электролита, приходящийся на единицу площади сечения геля в трубке, во много раз больше, чем для пластины, где весь этот объем ограничен жидкостью, пропитывающей полоску фильтровальной бумаги. Нередко в качестве католитов используют разбавленные растворы этилендиамина, этаноламина и триэтиламина. Как и для пластин, при использовании градиентов pH, сдвинутых в сторону от нейтральной области, в качестве одного из электролитов часто берут смесь нейтральных амфолитов, чтобы избежать опасности образования слоя чистой воды.
