Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
При ИЭФ особенно целесообразно пользоваться источниками тока постоянной мощности, так как сопротивление геля по мере утраты зарядов амфолитами непрерывно увеличивается. Напряжение, подаваемое на гель толщиной 2 мм в приборе Мультифор, может возрастать в ходе ИЭФ от начального значения 300—500 В в зависимости от выбранного интервала pH амфолитов до 1000 и даже 1500 В, в то время как сила тока падает от 80 до 20—25 мА. Эти ориентировочные цифры приведены для случая фокусирования в поперечном направлении. Плотность тока определяется напряженностью электрического тюля, которая в ходе ИЭФ может изменяться от 20—50 до 100— 150 В/см. Это намного больше, чем обычная напряженность поля при электрофорезе. Такая разница обусловлена заметно меньшей плотностью тока при электрофокусировании по сравнению с электрофорезом. При фокусировании белков в продольном направлении при таких же значениях напряженности поля и плотности тока общее напряжение, подаваемое от источника, должно быть больше, а суммарная сила тока — меньше в соответствии с увеличением длины и уменьшением сечения пластины геля.
В указанных условиях для широкого градиента pH 3,5—9,5 процесс ИЭФ большинства белков занимает 1,5—2 ч. Для узких диапазонов pH время ИЭФ приходится увеличивать, так как белки в этом случае заряжены слабее и движутся медлен-нее; разделение заканчивается за 3—4 ч. При этом предполагается, что через охлаждающий столик циркулирует вода при температуре 10°.
Иногда в результате остаточного эндосмоса (полностью убрать его не удается) катодная полоска фильтровальной бумаги может оказаться перенасыщенной жидкостью, которая будет видна по краям полоски. Эту жидкость следует удалить фильтровальной бумагой.
Прибор для горизонтального электрофореза FBE-3000 фирмы «Pharmacia» оснащен алюминиевым охлаждающим столиком с тефлоновым покрытием. Благодаря улучшенному теплоотводу мощность, рассеиваемую в геле, можно увеличить до 70 Вт. Даас и соавторы вели фокусирование белков на этом приборе (используя фармалиты) при напряжении до 3000 В от источника постоянной мощности ECPS 3000/150 производства той же фирмы. Напряженность поля при этом составляла в сред-
нем 350 В/см, а на отдельных участках геля доходила до 600. При температуре охлаждающей воды 8° температура геля устанавливалась примерно одинаковой по всей длине пластины (около 20°). В этих условиях продолжительность ИЭФ сокращается до 1 ч, а белковые полосы заметно сужаются, особенно в зонах с малым содержанием белка [Laas et al., 1980].
Заметим попутно, что надежным критерием достаточности времени ИЭФ для достижения белками равновесных положений является опять-таки совпадение белковых зон при внесении препарата как со стороны анода, так и со стороны катода.
Интересный подход при ИЭФ щелочных белков сыворотки был развит недавно Томасом и Ходсом. Его можно назвать двухстадийным процессом ИЭФ. На первой стадии в пластине ПААГ в присутствии 4 М мочевины и 15% глицерина формировали широкий и нелинейный градиент pH за счет следующей комбинации амфолитов: 0,6% pH 9—11 + 0,4% pH 7—9+0,2% pH 3,5—10. На большую часть пластины геля при этом ложился диапазон pH 8,5—10,5, где и оказывались интересующие авторов щелочные белки. Однако разделялись они плохо, так как основное падение напряжения приходилось на прилегавшую к аноду часть пластины геля, где располагались амфолиты нейтральной области pH, отличающиеся худшей электропроводностью. Туда же собирались и кислые белки сыворотки. Этот процесс занимал 3—4 ч. Для осуществления второй стадии фракционирования примерно треть прилегающей к аноду части геля вместе с находящимися в ней нейтральными амфолитами и кислыми белками отрезали бритвой и отбрасывали. Ленту анода переносили на новый конец геля и возобновляли электрофокусирование. Теперь все напряжение источника ложилось на нужную область pH и осуществлялось эффективное фокусирование щелочных белков [Thomas, Hodes, 1978].
Измерение pH
Для сопоставления результатов фракционирования белков, их идентификации и определения значений pi после окончания ИЭФ на пластине производят измерения pH в ряде точек вдоль градиента (рис. 11), используя специальные поверхностные (торцевые) стеклянные электроды с диаметром мембраны 1,5— 3 мм и расстоянием между электродами 3—5 мм. Ориентируясь по трафарету, измеряют pH в точках, отстоящих на 1 см друг от друга, и строят кривую фактического градиента pH. Поскольку pH зависит от температуры, измерения проводят, не снимая гель с охлаждающего столика прибора. Еще лучше термостати-ровать его при рабочей температуре, которая может быть заметно выше температуры охлаждающей жидкости столика. Зависимость величин pH и pi от температуры хорошо заметна при переходе от охлаждения при 4° к комнатной температуре. В ще-
лочной области изменение pH при таком переходе может составить 0,5 ед. pH.
В ходе измерения pH при выключенном напряжении белковые полосы несколько диффундируют. Перед окраской для их сужения напряжение фокусирования на 10—15 мин включают снова. Фирма «USB» {«United States Bio-Рис. 11. Измерение pH на поверх- chemical Corp.») выпускает набор ности геля торцевым стеклянным окрашенных маркеров pH для микроэлектродом ИЭФ, состоящий из цитохрома с
