Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
проникновения ее под действием поля в гель. В результате в нем могут возникнуть микропузыри, нарушающие однородность электрического поля. Во избежание этого фирма «Bio-Rad» рекомендует к 1 М NaOH добавлять до 0,02 М Са(ОН),.
Вообще опасность закисления щелочных участков, в том числе и самого градиента pH, при горизонтальном ИЭФ в открытых пластинах нельзя недооценивать. Такое закислеиие может приводить к заметным изменениям pH в геле и даже к выходу сильнощелочных белков из геля в катодный электролит [De-lincee, Radola, 1978]. Для устранения этой опасности желательно проводить ИЭФ в атмосфере азота или хотя бы помещать в электродный резервуар прибора (пустующий при ИЭФ) стаканчик с крепким раствором щелочи, а крышку прибора герметизировать липкой лентой.
Процитируем еще некоторые интересные рекомендации фирмы «Pharmacia» в отношении электродных растворов при использовании фармалитов. Для случаев, когда кислая граница градиента лежит в районе pH 3, фирма рекомендует в качестве анолита использовать 0,04 М раствор аспарагиновой кислоты, для pH 4—5 — такой же раствор глутаминовой кислоты, а для pH 6-8 — 0,25 М раствор продажного буфера HEPES.
Если прилегающая к катоду граница градиента лежит в области pH 5—6,5, в качестве католита фирма рекомендует 0, 2М раствор гистидина, а для более щелочных градиентов — 0,1 — 0,2 М раствор лизина или наконец, 1 М NaOH.
Для приготовления гелей удобно пользоваться 30%-ным маточным раствором смеси мономеров (29,1 г акриламида и 0,9 г метиленбисакриламида, вода до 100 мл), 10 мл которого достаточно для приготовления смеси с конечным объемом 60 мл. Туда же можно добавить 7 мл 87%-ного глицерина и 3 мл смеси концентрированных амфолитов в выбранной для данного
опыта пропорции. Разумеется, в отличие от гелей для электрофореза, никакого буфера здесь не нужно; остается добавить лишь персульфат аммония (после деаэрации смеси). Маточный раствор смеси мономеров следует профильтровать через мембранный фильтр с порами диаметром 1,2 мкм и хранить при 4° не более недели. При этом сосуд с раствором желательно обернуть фольгой, так как даже темное стекло недостаточно защищает его от света, под действием которого акриламид постепенно разлагается, давая в качестве одного из продуктов акриловую кислоту.
Использование мочевины к детергентов
Из-за снижения растворимости белков вблизи изоэлектриче-ской точки и опасности их осаждения иногда в состав геля для ИЭФ приходится вводить мочевину. Для плохо растворимых и склонных к агрегации белков это может быть необходимым с самого начала, еще на стадии приготовления препаратов. Многие гидрофобные белки для своего растворения нуждаются в добавлении детергентов, например неионных — типа Тритона Х-100 или Nonidet Р-40 (NP-40), Наконец, нередки случаи, когда надежное растворение белков удается обеспечить только совместным воздействием мочевины и детергентов.
Мочевину можно использовать в высокой концентрации (вплоть до 9 М). Она должна быть надежно очищена и деионизована с помощью бифункциональной ионообменной смолы. Неионные детергенты вводят в концентрации 1—3%. Будучи незаряженными, все эти добавки в первом приближении не сказываются на процессе образования градиента pH. Результирующая картина ИЭФ смеси белков при этом нередко заметно упрощается за счет исключения конфигурационной изомерии, приводящей к различной степени экранирования ионогенных групп белков и расщеплению их зон при фокусировании (см. выше). Чувствительность метода соответственно повышается.
Так, проводя ИЭФ в присутствии 9 М мочевины и 2%-ного раствора NP-40, Цехель надежно разделял а-субъединицы РНК-полимеразы из нормальных и зараженных фагом бактерий Е. coli (отличие сводится к присоединению одного остатка АДФ-рибозы), а также из диких и мутантных штаммов бактерий (замена одного аминокислотного остатка) [Zechel, 1977]. Кстати, на последнем примере можно оценить чувствительность метода ИЭФ: отличие в одну заряженную группу (замена лейцина гистидином) в белке с молекулярной массой 40 000 оказывается достаточным для разделения белковых полос. Впрочем, иногда разница между двумя белками может сводиться только к различию конфигураций (степени экранированности зарядов) ; тем не менее, при ИЭФ происходит разделение белков* По-видимому, именно этим можно объяснить наблюдавшееся тем же автором расщепление полосы актина после его обработ-
ки N-этилмалеинимидом— ведь изменения заряда при такой обработке не происходит.
Однако, связываясь с белком, детергент не только улучшает его растворимость, но и может вызывать артефакты дополнительного расщепления полос за счет маскирования каких-либо заряженных групп на поверхности белка или воздействия на характер их диссоциации. Такое явление недавно наблюдали Ригетти и соавторы при фракционировании а-, р- и у-глобинов.
Лиофилизированные суммарные препараты растворяли в 8 М растворе мочевины, содержавшем 3% NP-40 и 10% fl-меркаптоэтанола. ИЭФ проводили в горизонтальной пластине 6%-ного ПААГ на приборе Мультифор в смеси, содержавшей 2% амфолинов pH 6—8 и 0,2% амфолинов pH 3,5—-10. При полимеризации геля в одном случае добавляли в него до 8 М мочевину, а во втором— еще и NP-40 до концентрации 3%. Во втором варианте разделение полос а-, р- и у-глобинов улучшалось, но сами эти полосы расщеплялись [Righetli et al., 1979].
