Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
H3N+---СН-СОО-
По аналогичным причинам какая-то часть а-карбоксилов окажется недиссоциированной, так что в растворе будут присутствовать и положительные ионы:
Разумеется, в растворе имеет место динамическое равновесие процессов ионизации и нейтрализации, в котором участвуют все молекулы глутаминовой кислоты, но статистически обеспечиваются вполне определенные соотношения между концентрациями ионов обоих знаков [Глу-] и [Глу+] и суммарной концентрацией глутаминовой кислоты [Глу]. Эти соотношения следуют из закона действующих масс и могут быть записаны сле-
соо-
H3N+---СН-СООН
I
<СН2)2
/
соон
Дх7о^™°бРаЗОМ: [ГлУ+^[Глу]ХЮ^-^; [Глу-] = [Глу]Х
Если сюда подставить известные значения р/Сь рКг и pi для
глутаминовои кислоты, то легко убедиться, что концентрации ионов обоих знаков в точности одинаковы и не очень малы — около 10 /о от общей концентрации глутаминовой кислоты. Но как положительные, так и отрицательные ионы могут участвовать в проведении электрического тока. Таким образом, раствор глутаминовой кислоты при рН=р[, будучи в целом электрически нейтральным, вполне успешно может проводить ток.
Если аналогичный расчет провести для раствора глицина, то легко убедиться, что концентрация ионов в нем и соответственно электропроводность в изоэлектрической точке очень малы. Это также обусловлено большой удаленностью значений pKi и рЯа Друг от друга и от лежащего между ними значения pi, В общем случае электропроводность амфолитов в изоэлектрической точке, как и их буферная емкость, оказывается тем выше, чем ближе друг к другу значения рК, между которыми располагается изоэлектрическая точка*
Описанное явление обеспечивает стационарный уровень электропроводности в любой точке установившегося градиента pH. Не следует думать, что при протекании тока градиент будет «смазываться». Ионы амфолитов, покидающие под действием поля область своего сосредоточения, попадают в соседний участок градиента с иным pH. Там они легко разряжаются, отдавая свой заряд амфолитам этого участка, и останавливаются. Мало того, при pH, отличающемся от их pi, прибывшце с током и разрядившиеся ионы склонны приобрести противоположный заряд, что их заставит вернуться в свою исходную зону.
Таким образом, возникает своеобразная эстафета с передачей зарядов ионами амфолитов, совершающих колебательные движения в окрестностях своих зон сосредоточения. Вдоль градиента pH протекает вполне заметный электрический ток, а сам градиент остается при этом неизменным.
СВОЙСТВА ПРОДАЖНЫХ АМФОЛИТОВ
Главная проблема, возникающая при синтезе амфолитов, состоит в том, чтобы обеспечить одинаковую электропроводность в любой точке градиента pH. Полностью решить ее не удается, Амфолиты с pi, лежащими вблизи нейтральной области pH, диссоциируют все-таки хуже, чем амфолиты с кислыми или щелочными значениями pi, хотя эти различия, конечно,^ не столь велики, как между глицином и глутаминовой кислотои. В силу этого электропроводность в нейтральной зоне широкого градиента pH в несколько раз ниже, чем на его краях (рис. 4; [Gei-sema et ai., 1979]). На рисунке показаны кривые электропроводности 1%-ных растворов амфолитов трех различных марок.
I ,1, I,----------------------------------------------------^----------------i— — r
/
/
/
---- -- -=E---1--i______t-1—
3 4$ 6 7 8 9 pH
3436 789 pH
Рис. 4. Распределение электропроводностей 1%*ны;х растворов амфолитов вдоль градиента pH [Geiseme et at, 1979]
/ — сервалиты; 2 — амфолшш; 3 — фармалиты
Рис* 5, Распределение буферных емкостей 1 %-ных растворов амфолитов вдоль градиента pH [Geiseme et at, 1979]
Обозначения те же. что на рис. 3
Данные по биолитам не приведены, поскольку их промышленный выпуск начат только в 1980 г.1
Заметно, что наиболее широким интервалом pH, в пределах которого электропроводность меняется незначительно, отличаются фармалиты. При ЙЭФ, как и при электрофорезе, малая электропроводность — это преимущество амфолитов, поскольку она позволяет создавать электрическое поле повышенной напряженности без опасности перегрева геля или жидкости. Важно лишь, чтобы эта проводимость была более или менее одинаковой по длине градиента во избежание образования локальных горячих участков. Они могут возникать именно в областях пониженной проводимости вблизи нейтральных значений pH. Это легко понять, если вспомнить, что сила тока одинакова по всей длине градиента, а напряженность ноля максимальна именно в этих областях.
Для полноты сопоставления трех типов фирменных амфолитов на рис. 5 приведены заимствованные из той же работы кри~ вые изменения буферной емкости вдоль градиента pH, также для 1%-ных растворов амфолитов. Видно, что фирмам «LKB» и «Pharmacia» удалось создать амфолиты, обладающие примерно одинаковой буферной емкостью вдоль всего диапазона pH, в то время как емкость сервалитов вблизи нейтральных значений pH заметно снижается. Впрочем, следует иметь в виду, что это обстоятельство может привести к осложнениям только в случае высокой загрузки градиента белком, например при препаративном ИЭФ. В аналитическом варианте буферная емкость амфолитов редко является лимитирующим фактором.
