Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 16

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 10 11 12 13 14 15 < 16 > 17 18 19 20 21 22 .. 140 >> Следующая

(р1=10,6) и серии его ацетилированных производных с р! 9,7, 8,3, 6,4, 4,9 и 4,1.
Отметим также, что в концентрированном растворе мочевины pH градиента измеряется с некоторым завышением. Например, для 4 М раствора мочевины это завышение составляет около 0,3 ед. pH. Наконец, сами значения pi белков могут несколько изменяться в присутствии высоких концентраций мочевины, сахарозы или глицерина. Это происходит как за счет изменения диэлектрической проницаемости среды, так и за счет конформа-ционных перестроек самих белковых молекул. Уже упоминалось, что эти перестройки могут приводить к изменению степени экранированности и характера диссоциации ионогенных групп белков. В этих условиях использование р1-маркеров, т. е. белков с заранее известными значениями pi, представляется особенно привлекательным. Недавно фирма «Pharmacia» выпустила три набора таких маркеров, содержащих от 8 до II белков в каждом. Маркерные белки порознь или в смеси можно вносить на отдельный трек при ИЭФ в пластине или добавлять к белковому препарату в случае вертикального ИЭФ в трубке. Один из маркеров в каждом наборе представлен окрашенным белком, что позволяет следить за ходом фокусирования. Наборы под названием «Focusing Calibration Kit» выпускаются для следующих диапазонов pH: 2,5—6,5, 5—10,5 и 3—10.
Окрашивание белковых зон
Перед окрашиванием белки фиксируют, как обычно, осаждением кислотой, одновременно стараясь удалить из геля амфолиты. Необходимость этого обусловлена тем, что со многими белковыми красителями амфолиты образуют нерастворимые окрашенные комплексы. Обычно гель после ИЭФ вымачивают в течение 30—60 мин в водном растворе, содержащем 3,5% суль-фосалициловой кислоты и 10,5% ТХУ (масса/объем). Затем гель в течение 15 мин промывают в водном растворе уксусной кислоты (8%) и этанола (25%). Окрашивают гель 0,1%-ным раствором обычного для электрофореза белков красителя Кумас-
си ярко-голубого (СВВ R-250) в этой же смеси в течение 10 мин при 60°. Избыток красителя отмывают в течение 12—18 ч тем же растворителем, с несколькими его сменами.
По внешнему виду гель, окрашенный после ИЭФ белков в нескольких параллельных треках, мало отличается от геля после электрофореза, если не считать того, что белковые полосы обычно уже и более резко очерчены.
Окрашивание и отмывку удобно производить в ванночке с подъемной сеткой, на которую и кладут пластинку с гелем. Такое приспособление не будет лишним, поскольку гель при окрашивании и отмывке нередко отделяется от стеклянной пластинки и может при вынимании из раствора соскользнуть с нее и сломаться. Для дальнейшего хранения окрашенного геля его следует предварительно подержать около часа в 10%-ном растворе глицерина в той же смеси. Затем гель вместе с пластинкой можно обернуть смоченным целлофаном и в таком виде высушить при комнатной температуре или при 50°. Благодаря глицерину пленка высохшего геля сохраняет прозрачность и не трескается. Высушенный без глицерина ПААГ оказывается мутным и хрупким. Гели, снятые со стеклянной пластинки, хорошо сушить на рентгеновской или фотопленке, с которой предварительно смыли эмульсию. Влажный гель надежно прилипает к нитроцеллю-лозной пленке и высыхает на ней при комнатной температуре или при обдувании его теплым воздухом без деформаций и отслаивания. Готовые пластинки типа «PAG plates» можно сушить, не заворачивая их в целлофан.
Быстрая окраска. Можно окрашивать гели и 0,075%-ным раствором красителя СВВ G-250 в 3,5%-ном водном растворе хлорной кислоты. При растворении красителя суспензию перемешивают в течение часа, а затем фильтруют через бумажный фильтр. Гель окрашивают в течение часа при комнатной температуре. Фиксация и окраска белков происходят одновременно; амфолиты при этом окрашиваются слабо. Затем гель споласкивают 3,5%-ным раствором НСЮ4 2—3 раза по 5 мин. Белки четко проступают в виде синих линий на бледно-оранжевом фоне. Чувствительность такой окраски — ниже, чем в предыдущем варианте, но выигрыш во времени очень существенный.
Безфоновые методы окраски. Ригетти и Дрисдаль предложили метод окрашивания гелей после ИЭФ, в котором высокая чувствительность сочетается с низким уровнем фона. Гель погружают на 4—б ч в 0,1%-ный раствор сернокислой меди (CuSOt) в смеси уксусной кислоты, этанола и воды (19:25:65 по объему), содержащий также 0,05% красителя СВВ R-250. Сернокислая медь препятствует окрашиванию амфолитов. Гель отмывают сначала в течение 4 ч в том же растворе, но содержащем 0,01 % красителя, затем в смеси тех же растворителей, но в несколько иной пропорции (1:1:8). Манипулировать с гелем следует в перчатках, так как метод достаточно чувствителен
для выявления отпечатков пальцев на поверхности геля Г Rirr-hetti, Drysdale, 1976].
Ригетти и Чиллеми приводят вариант окрашивания с использованием красителя СВВ G-250, при котором используется серная кислота и амфолины не прокрашиваются. К 0,2%-ному водному раствору красителя они рекомендуют прилить равный объем 2 н. раствора H2S04, перемешивать в течение 3 ч, затем смесь отфильтровать и к прозрачному фильтрату коричневого цвета добавить */* объема 10 н. раствора КОН. Раствор приобретает пурпурную окраску. Наконец, в него добавляют ТХУ до конечной концентрации 12% (вес/объем). Полученный раствор зеленовато-голубого цвета готов к употреблению. Гель выдерживают в нем при покачивании в течение 3 ч, потом переносят в воду, где синий цвет окрашенных полос еще усиливается. Фона нет, так что отмывать гель не нужно.
Предыдущая << 1 .. 10 11 12 13 14 15 < 16 > 17 18 19 20 21 22 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed