Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Таким образом, ИЭФ приводит к стационарному состоянии не ограниченному временем, — это третья особенность процесс; Устанавливается некое динамическое равновесие. Полоса «сфс кусированного» белка не является, разумеется, бесконечно у: кой; ее ширина пропорциональна количеству содержащегося ней белка. Но все же она оказывается гораздо более узкой, че при электрофорезе с такой же степенью «загрузки» зоны. Че уЬке полосы, тем ближе друг к другу могут быть значения р двух разделяющихся белков. Современная техника электрофс кусирования позволяет разделять в виде отдельных полос бе/ ки, у которых значения pi отличаются всего лишь на 0,01. Вь сокая разрешающая способность — это четвертая особенност метода ИЭФ; ее иллюстрирует рис. 1 [Bishop, 1979а].
Важно подчеркнуть одно обстоятельство, которое часто не дооценивается при трактовке сложных картин разделения пр ИЭФ, особенно содержащих близко лежащие полосы. В прс цессе ИЭФ участвуют не все ионо генные группы данного бел к* а только те, которые лежат на поверхности белковой глобул] и контактируют с растворителем. Только они могут диссоц^ ровать, определяя суммарный заряд белка. В силу этого знач« ние pi для одного и того же белка в разных конформациях мс жет изменяться. Конформационные перестройки могут прош ходить в результате окисления и разрыва внутримолекулярны дисульфидных мостиков, например в ходе подготовки препарг та или за счет остаточных радикалов персульфата в ПААГ. Он могут быть обусловлены действием мочевины и других диссощ ирующих агентов, введенных в гель. То же происходит при час тичной денатурации белка — либо тепловой (в ходе миграци через перегретые участки геля), либо под воздействием экстр« мальных значений pH для белков, оказавшихся исходно на крг ях градиента. Конформация белка может измениться в резул! тате нарушения его связи с лигандами или образования коь
плексов с липидами, углеводами, субстратами ферментов и др. Наконец, это может произойти просто в силу присущей данному белку конформационной изомерии. Таким образом, наличие двух близко расположенных линий после ИЭФ еще не говорит
о разделении двух различных по первичной структуре белков. Для такого утверждения нужна дополнительная проверка, например путем вариации условий фокусирования или предварительной обработки белковых препаратов.
Важной особенностью и достоинством метода ИЭФ является и то, что он позволяет легко определять такой важный параметр белка, как pi. Дело сводится к измерению pH в той точке градиента, где находится зона этого белка после окончания процесса ИЭФ.
АМФОЛИТЫ ДЛЯ ИЭФ
Перейдем к выяснению вопроса о том, каким образом создается градиент pH. Собственно говоря, его создает само электрическое поле. Это обусловлено особыми свойствами среды, которая выше была названа «электропроводящей жидкостью». Она представляет собой водный раствор смеси большого числа различных типов амфотерных молекул сравнительно небольшой молекулярной массы (300—900). Такого рода смеси для ИЭФ выпускаются под различными фирменными названиями: амфо-лины («LKB»), фармалиты («Pharmacia), сервалиты («Ser-va») и биолиты («Bio-Rad»). Все они представляют собой искусственно синтезированные наборы цвиттерионов, отличающихся друг от друга внутри каждого набора значениями своих pi, более или менее равномерно перекрывающих диапазоны от 2—3 до 10—11 единиц pH. Щелочные группы в них представлены замещенными аминами, а кислые — остатками карбоксилов (амфолины, фармалиты) или сульфокислот (сервалиты, биолиты).
Особенностью амфотерных веществ такого рода является то, что при растворении в воде каждое из них «стремится» изменить pH раствора таким образом, чтобы приблизить его к своему значению pi. При этом протоны диссоциируют от остатков кислот и присоединяются к аминогруппам. Например, при растворении в воде простейшей аминокарбоновой кислоты (глицина) устанавливается pH около 6. При этом практически для всех молекул глицина будет справедлива структурная формула H3N+—СН2—СОО-. Стопроцентная ионизация обусловлена тем, что для карбоксила в глицине (р/С—2,34) среда с pH 6 оказывается слишком щелочной, а для аминного конца (р/(—9,6) — сильнокислой. Протон как бы перебрасывается с карбоксильного на аминный конец каждой молекулы, и водная среда остается почти нейтральной.
На рис. 2 кривая 1 описывает процесс титрования глицина. Почти горизонтальный участок этой кривой в интервале pH
Рис. 2. Кривые титрования растворов аминокислот
/ — глицин; 2 — глютаминовая кислота; 3 — лизин; Z — суммарный Электр и ческш! заряд молекулы
4,5—8 говорит о том, что буферная емкость раствора глицина вблизи изоэлектрической точки (pi—5,97) ничтожно мала. Очень малых до-< бавок кислоты или щелочи будет достаточно для того, чтобы изменить pH раствора до значения, соответствующего одной из границ
указанного интервала pH, где на-
чинает проявляться буферный эф-* фект. Это происходит потому, что два значения рК. для глицина
сильно отличаются друг от друга («буферность» всегда про-
