Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
является при pH, близких к рК).
Для осуществления ИЭФ амфолиты не только должны задавать каждой точке градиента определенное значение pH, но и обеспечивать в этой точке буферную емкость, достаточную для того, чтобы это значение не зависело от присутствия белка в растворе. Очевидно, что глицин нельзя использовать в качестве амфолита для ИЭФ.
Иная картина получается, например, в случае глутаминовой кислоты. Две ее карбоксильные группы в а- и ^-положениях имеют соответственно p/Ci=2,19 и рХ2=4,25; для аминогруппы р/С3=9,67. Изоэлектрическая точка глутаминовой кислоты — 3,22. При растворении этой аминокислоты в воде процесс диссоциации протонов от двух карбоксильных остатков преобладает над присоединением одного' протона к аминогруппе, вследствие чего водный раствор будет закисляться до тех пор, пока pH не достигнет 3,22. При этом pH аминогруппа заведомо про-тонирована, а из двух карбоксилов заряжен в большинстве случаев будет только стоящий в ct-положении, для которого среда dpH 3 ,22 — еще достаточно щелочная. Таким образом, в растворе будет преобладать следующая структура:
HgN+----СН-СОО-
Ч
(СН2)2
/
соон
Вторая карбоксильная группа остается преимущественно не-диссоциированной, так как для нее pH 3,22 представляет собой кислую среду. Молекула глутаминовой кислоты оказывается в целом нейтральной за счет того, что при ее растворении в воде происходит закисление до pH 3,22. По характеру кривой 2 на рис. 2 можно заключить, что такой раствор должен обладать
я
хорошей буферной емкостью. Изоэлектрическая точка в этом случае вместо горизонтальной площадки лежит на крутом участке кривой титрования. При добавлении кислоты изменение pH предотвращается протонированием карбоксила в a-положении, а при добавлении щелочи — диссоциацией протона от карбоксила в ¦у-положении. Отметим относительную близость значений p/Ct и р/С2, между которыми располагается изоэлектрическая точка.
Аналогичные процессы, но в щелочной области pH, протекают при растворении лизина. Для его единственного карбоксила р/(1=2,18, а для двух аминогрупп в а- и е-положениях соответственно р/Са=8,95 и р/С3= 10,53. Изоэлектрическая точка лизина — 9,74. По аналогии с изложенным легко понять, каким образом при растворении в воде лизин защелачивает ее до pH 9,74, сам при этом оказывается электрически нейтральным и, судя по кривой 3 на рис. 2, обеспечивает высокую буферную емкость. Отметим и здесь близость значений р/(2 и рК3, между которыми лежит pi.
Два последних примера показывают, каковы должны быть особенности структуры амфолитов, отвечающих условиям образования градиента, т. е. обладающих способностью задавать раствору нужное значение pH, при этом нейтрализуясь и обеспечивая хорошую буферную емкость раствора. По-видимому, это должны быть молекулы, несущие комбинации из нескольких, не обязательно первичных, аминов и карбоксилов (или других кислотных остатков), связанных между собой короткими углеводородными цепочками таким образом, чтобы взаимная нейтрализация зарядов при растворении сопровождалась установлением нужного pH раствора, равного pi данного амфолита. Для обеспечения хорошей буферной емкости значение pi должно лежать между двумя близко расположенными р/С.
Достаточно разнообразный набор таких амфолитов был синтезирован в 1969 г. Вестербергом, что послужило основой для промышленного производства амфолинов фирмой LKB, а затем и для широкого распространения метода ИЭФ.
СОЗДАНИЕ ГРАДИЕНТА pH
Посмотрим теперь, каким образом создают градиент pH в жидкости или геле. Первоначально во всем объеме жидкости растворяют до суммарной концентрации 1—2% смесь всех амфолитов, перекрывающих выбранный интервал значений pi. Если ИЭФ предполагают вести в геле, то в этом растворе поли-меризуют акриламид или агарозу, что не меняет характера описываемых ниже процессов, поскольку для миграции низкомолекулярных амфолитов сетка геля существенного сопротивления не представляет. В состав смеси входят амфолиты с различными значениями pi примерно в эквимолярном соотношении. Как и в случае смеси различных буферов, их совокупное воздейст-
вие на водную среду определит некоторое среднее значение pH, одинаковое по всему объему трубки или пластины. При этом pH лишь один из амфолитов (если для него р1 = рН) может оказаться незаряженным. Для всех остальных значений pi будут более или менее заметно отличаться от исходного pH смеси, поэтому практически все амфолиты окажутся положительно или отрицательно (слабо или сильно) заряженными. В ходе описанного ниже процесса формирования градиента заряд при-обретает и тот единственный амфолит, который первоначально оказался незаряженным.
При наложении электрического поля все амфолиты начнут мигрировать в направлении анода или катода в зависимости от знака их заряда. Следует подчеркнуть, что никаких других ионов в растворе быть не должно; миграция амфолитов и составляет электрический ток в жидкости. Конечно, в переносе тока 'будут участвовать еще и ионы Н+ и ОН-. Но даже в тех случаях, когда используют смесь кислых или щелочных амфолитов, концентрация этих ионов будет очень мала по сравнению с концентрацией самих амфолитов.
