Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
дающиеся в образовании описанной в части II пространственной сетки. Тем самым снимается сформулированное ранее требова* ние эквивалентности концентраций антител и антигенов — их иммунные комплексы осаждаются или сорбируются независимо друг от друга. В связи с этим открылась и оказалась особенно плодотворной возможность использования конкуренции радио-активных и немеченных антигенов за образование иммунных комплексов с антителами, находящимися в недостатке (лимитирующими реакцию), как было описано в методе изотопного разбавления. Такой подход позволяет осуществить количественное определение ничтожного содержания некоего антигена в сложной смеси нативного немеченного препарата, если в распоряжении экспериментатора имеется соответствующее радиоактивно меченное чистое вещество.
Другим плодотворным приемом оказалось использование двойных и тройных иммунных систем, когда, например, к первоначальным комплексам антиген—антитело присоединяются антитела, полученные от другого животного, иммунизированного сывороткой первого донора. Эти так называемые «вторичные» антитела «узнают» антитела, входящие в состав первичного иммунного комплекса, поскольку для второго животного первичные антитела являются антигенами. Кроме того, в систему можно ввести еще и белок А, способный присоединяться к одинарному или двойному иммунному комплексу, поскольку константная часть соответственно первичного или вторичного антитела в этих комплексах остается свободной. Белок А можно иммобилизовать на некоей матрице, создав тем самым сорбент для антител и иммунных комплексов. Этот белок можно использовать и прямо в составе бактериальной стенки. Убитые, но не разрушенные бактерии Staphylococcus aureus, за счет белка А способны связывать кммунные комплексы, в результате чего преципитация этих комплексов из раствора сводится к осаждению бактерий низкоскоростным центрифугированием.
Детали использования этих и других подходов в наборе радио-иммунных методов будут описаны ниже. Прежде чем обратиться к наиболее тонким — конкурентным методам изотопного разбавления, рассмотрим подробно упомянутые выше новые способы преципитации и сорбции индивидуальных иммунных комплексов. Для простоты и, вместе с тем, полноты освещения этого вопроса начнем с некоторых примеров выделения нерадиоактивных комплексов. Это послужит введением к использованию тех же приемов в сочетании с радиоактивной меткой.
ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИЯ И СОРБЦИЯ ИЗ РАСТВОРА
Система двух антител
Рассмотрим в качестве примера недавно опубликованный способ очистки пуриннуклеотидфосфорилазы (ПНФ) из плаценты методом иммунопреципитации [Changas, Reem, 1979].
Сначала получали антисыворотку против ПНФ. Для этого очищенный фермент в концентрации 0,75 мг/мл гомогенизировали с равным объемом адъюванта Фрейнда, предварительно разбавленного вдвое 0,01 М К-фосфатным буфером (pH 7,3) с 0,15 М NaCl. По 150 мкг фермента в этой смеси вводили кролику подкожно, одновременно в пяти местах. Инъекции повторяли на 14, 51 и 72-й дни. Спустя еще 10 дней титр специфических антител (по Ухтерлони) достигал наибольшего уровня. После этого отбирали кровь и обычными приемами очищали антисыворотку кролика против ПНФ.
Иммунопреципитацию осуществляли следующим образом. 0,1 мл суммарной ферментной фракции из плаценты суспендировали в буфере (0,02 М Трис-НС1, pH 7,9+5 мМ MgCl2+0,l мМ ЭДТА+0,6 мМ ДТТ+20 мМ КС1), содержащем по 0,25% Тритона Х-100 и дезоксихолата натрия. Детергенты были введены для предотвращения возможности неспецифической агрегации компонентов иммунной реакции и их комплексов. К суспензии добавляли 0,5 мкл иммунной антисыворотки кролика. Это количество антисыворотки содержит большой избыток антител по отношению к находящемуся в 0,1 мл ферментной фракции количеству ПНФ. Такой избыток, с одной стороны, обеспечивает связывание в индивидуальные иммунные комплексы (здесь сетка не образуется) всех молекул ПНФ, а с другой—подготавливает выполнение условия эквивалентности концентрации для образования пространственной сетки со вторичными антителами козы, для которых антитела из сыворотки кролика являются антигенами. Если для полного связывания ПНФ можно обойтись меньшим, чем 0,5 мкл, объемом иммунной антисыворотки кролика, то этот объем следует дополнить до 0,5 мкл его неиммунной сывороткой. В отношении взаимодействия со вторичными антителами обе сыворотки эквивалентны.
Ферментную фракцию с добавленной в нее антисывороткой кролика инкубировали 3—5 ч на холоду. За это время реакция образования первичных иммунных комплексов проходила до конца. Преципитата, как уже упоминалось, не образуется из-за ничтожности концентрации антигена (ПНФ) и неэквивалентности концентраций антигена и первичных антител. Затем к смеси добавляли 3,5 мкл продажного препарата антисыворотки козы против иммуноглобулинов кролика и инкубировали еще 3—5 ч на холоду. Теперь уже формировалась сетка иммунопреципитата, где в качестве антигенов выступали иммуноглобулины кролика, связанные или не связанные в иммунные комплексы с ПНФ.
