Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Соотношение 0,5 мкл сыворотки кролика и 3,5 мкл антисыворотки козы, очевидно, было подобрано как оптимальное (эквивалентное) их соотношение для иммунопреципитации. Такой преципитат легко осаждается центрифугированием. Фермент из осадка нетрудно освободить, диссоциируя иммунный комплекс подкислением.
В принципе аналогичный прием используется для выделения индивидуальных мРНК. Методом иммунопреципитации в системе двух антител удается отобрать и отделить полисомы, ведущие синтез именно того белка, который кодируется нужной мРНК. Очевидно, что и сама эта мРНК отделяется вместе с полисомами от всех прочих мРНК, каково бы ни было их разнообразие и обилие в системе, где могут одновременно идти синтезы сотен других белков. Отбор производится в тот момент, когда полипептидная цепочка названного белка еще не отделилась от полисомы — первичные, «распознающие» антитела вырабатываются именно против этого белка. Их с избытком «сажают» на полисомы, а затем вносят вторичную антисыворотку против первичных иммуноглобулинов в эквивалентной с ними концентрации. В образующийся преципитат попадают только полисомы, ведущие синтез данного белка, а вместе с ними и кодирующая его мРНК. В этих опытах первичные антитела обязательно очищают на иммуносорбенте или иным путем, чтобы повысить их специфичность к нужному белку. Для иллюстрации описываемого подхода, а также некоторых дополнительных иммунохимических приемов процитируем- некоторые моменты из недавней работы, где проводилась очистка мРНК галактокиназы (ГК) из дрожжей [Schell, Wilson, 1979].
1,5 мг хорошо очищенной ГК диализовали против 0,01 М Na-фосфатного буфера (pH 7) и добавляли к ней 1 мг метилированного БСА, так что конечный объем раствора составлял 1 мл. Его эмульгировали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда многократным пропусканием через иглу 22-го калибра. Кролика иммунизировали введением этой эмульсии между подушечек лап дважды, с интервалом в 2 недели (второй раз — 0,5 мг Г'К). Затем в течение 1—2 недель с интервалом в 3 дня из ушной вены отбирали по 50 мл крови для выбора препарата с наибольшим титром специфических антител (по Ухтерлони).
IgG тщательно очищали от примести РНКазы— это важно для последующей сохранности мРНК. Глобулины иммунной сыворотки осаждали сульфатом аммония (40% насыщения), пере-растворяли, диализовали против 0,01 М Na-фосфата (pH 7,2) с 0,15 М NaCI и очищали в двухслойной колонке ДЭАЭ-целлюлозы (нижний слой) и КМ-целлюлозы, уравновешенной тем же буфером. IgG свободно проходят через такую колонку, а РНКаза в ней полностью задерживается. После дополнительной очистки IgG гель-фильтрацией на сефадексе G-100 следовал важный этап повышения степени специфичности препарата IgG (напомним о полиспецифичности иммунного ответа, а также о том, что иммунизация резко увеличивает содержание в сыворотке специфических антител, но не удаляет из нее исходные, нормальные антитела). В данном случае для этой цели удобно было воспользоваться мутантным штаммом дрожжей, практически лишенных галактокиназы.
Иммунный IgG инкубировали с цитозолем мутантного штамма. Все примесные IgG кроме ГК-специфичного, связывались с соответственными белками цитозоля (антигенами). Оставшиеся свободными ГК-специфичные антитела очищали в той же последовательности операций, что и выше. Разумеется, инкубации предшествовала жесткая обработка цитозоля ингибиторами про-теаз: диизопропилфторфосфатом (0,016%) и фенилметилсульфо-нилфторидом (4 мМ) в течение 2 ч при 4°.
Для отбора путем иммунопреципитации в буфер (0,025 М Трис-НС1, pH 7,1, +0,15 М NaCl-f-5 мМ MgCl2+0,5 мг/мл гепарина) вносили полисомы нормального штамма дрожжей до концентрации 28 ед. Л280 на 1 мл и очищенный IgG против ГК в концентрации 0,7 мг/мл. Для дополнительной (конкурентной) защиты от РНКаз, помимо гепарина, добавляли еще тРНК Е. coli до концентрации 50 мкг/мл. Эту смесь инкубировали 45 мин при 0°, затем добавляли, как и выше, антисыворотку козы против иммуноглобулинов кролика в отношении 50:1 (объем/масса) к содержащемуся в смеси IgG и держали еще час при 0°. Центрифугирование (10 000g; 15 мин) осаждало только полисомы, ведущие синтез ГК и «заряженные» соответствующей мРНК. Затем следовала обычная процедура депротеинизации и отделения мРНК от рибосомальных РНК на олиго(<И)-целлю-лозе.
В другой аналогичной работе при очистке мРНК для легкой цепи миозина (ЛЦМ) из сердца зародыша цыпленка обогащение антисыворотки нужным IgG вели, как обычно, на иммуносорбенте, используя для этой цели ЛЦМ, «посаженную» на BrCN-акти-вированную сефарозу 4В. IgG против ЛЦМ сорбировали из иммунной антисыворотки на иммуносорбент и промывали там, а затем десорбировали его высокой концентрацией соли двухвалентного металла (4,5 М MgCl2).
Для облегчения преципитации вторичные антитела козы добавляли не в растворе, а в виде уже нерастворимой пространственной сетки, предварительно сшитой глютаровым альдегидом. Такая сетка вполне успешно извлекает из раствора и связывает первичные антитела вместе с полисомами. Это освобождает от заботы об эквивалентности концентраций первичных и вторичных антител и достаточности этих концентраций для образования иммунопреципитата [Arnold, Siddiqui, 1979].
