Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
После выдерживания смеси в течение еще одного часа бактерии собирали центрифугированием и промывали буфером. Для подготовки к последующему анализу электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na осадок суспендировали, как обычно, в 3%-ном растворе ДДС-Na с 0,7 М ,|3-меркаптоэтанолом, .10% глицерина и 0,06 М Трис-НС1 (pH 6,8) и прогревали при 100° в течение 5 мин. Такая обработка одновременно диссоциирует иммунные комплексы и освобождает интерферон.
В этой же работе для тех же целей иммунопреципитации использовали вместо S. aureus суспензию белка А, ковалентно закрепленного на гранулах сефарозы. Продажный препарат этого своеобразного сорбента поставляется фирмой «Pharmacia» в виде лиофилизированного порошка под торговым названием «Protein A-Sepharose CL4B».
В 1 мл набухшего сорбента содержится 2 мг белка А, способного связать 20 мг IgG (молекулярная масса белка А вчетверо меньше, чем у IgG, и на одной молекуле белка имеется несколько участков связывания).
На поверхности бактерий может происходить неспецифическая сорбция продуктов трансляции. Это обстоятельство в аналогичной работе было учтено: в 120 мкл инкубационной смеси после удаления из нее рибосом (центрифугированием) вносили 50 мкл «Pansorbin» одновременно с детергентом NP-40 (0,25%). После 15-минутной выдержки на холоду эту порцию бактерий удаляли центрифугированием. Только после этого к супернатанту добавляли специфическую антисыворотку и новую порцию «Pansorbin» [Towle et al., 1980]. Такой же прием был использован несколько раньше [Ibarie, Jones, 1979].
Двукратная иммунопреципитация с участием S. aureus была использована в изящной работе Кингсман и соавторов для выделения вирусспецифического белка из культуры клеток почки обезьяны, зараженных вирусом SV-40. 100 мкл клеточного экстракта сначала инкубировали с 9 мкл нормальной сыворотки хомячка (2 ч, 4°), затем добавляли 100 мкл «Pansorbin», инкубировали еще 30 мин и осаждали бактерий центрифугированием. Таким образом, из экстракта были удалены все белки-антигены, связывающиеся с нормальными компонентами сыворотки хомячка. К супернатанту добавляли еще 7 мкл сыворотки хомячка, имевшего опухоль, индуцированную вирусом SV-40. Сыворотка такого хомячка, очевидно, содержит в своем составе дополнительные антивирусные антитела. За более продолжительной инкубацией (24 ч, 4°) следовало внесение новой порции «Pansorbin», который на этот раз осаждал только вирусспеци-фические иммунные комплексы [Kingsman et al., 1980].
«Protein А-Sepharose» была использована недавно для быстрого выделения методом иммунопреципитации комплекса трех ферментов, осуществляющих первые этапы метаболизма пири-мидинов и составляющих в сумме всего лишь 0,05% суммарного клеточного белка. Иммунный комплекс сначала снимали с сорбента экстракцией 1 М CHsCOOH, а затем диссоциировали в денатурирующем буфере с ДДС-Na для последующего электрофореза [Davidson, Patterson, 1979].
«Посадив» на «Protein А-Sepharose» моноспецифические антитела, можно получить иммуносорбент, пригодный для очистки соответствующего антигена. В интересах надежного и многократного использования такого иммуносорбента относительно
слабое связывание антител с белком А следует заменить на ковалентную связь путем «сшивки» белков с помощью какого-либо бифункционального агента. В частности, хорошие результаты были получены при использовании для этой цели диметилсубе-
римидата Н3С—О—С (NH2) — (СНг) в—С (NH2) —О—СНа. По-
видимому, значительная длина такого «мостика» облегчает доступ антигена к иммобилизованному антителу и обеспечивает необходимую 'для образования комплекса свободу его ориента* ции [Reeves et al., 1981].
Все эти современные методы осаждения иммунных комплексов не связаны с использованием радиоактивности, однако сведения о них полезны при рассмотрении способов такого использования, к которым теперь можно перейти. Первые два способа относятся к простой преципитации, поэтому их уместно рассмотреть в данной главе.
Радиоактивно меченные антитела
Как будет видно из дальнейшего, радиоактивную метку чаще всего вводят в антигены для использования их в методах конкуренции. Но иногда метка в антиген включается плохо (мало тирозина!) или нарушает антигенные свойства белка (тирозин в антигенном детерминанте). В этих случаях бывает целесообразно ввести метку 1251 в специфические антитела, участвующие в иммунопреципитации исследуемого антигена. Например, для количественного определения содержания ли-попротеинлипазы (ЛПЛ) цыплят Шенг и соавторы использовали следующий прием. Антитела против ЛПЛ получали из иммунной сыворотки козы и очищали их на иммуносорбенте, которым служила очень чистая ЛПЛ, иммобилизованная на сефарозе. Часть очищенных антител с помощью карбодиимида закрепляли на полиакриламидных гранулах типа «Immunobe-ads» (см. выше), а другую часть метили радиоактивным иодом. Тканевому экстракту, в котором определяли ЛПЛ, давали прореагировать с заряженными гранулами, проверив, что ЛПЛ в экстракте находится в недостатке по отношению к количеству закрепленных специфических антител. Затем гранулы промывали и инкубировали с избытком радиоактивно меченных антител к ЛПЛ. По связывающейся с гранулами радиоактивности с помощью калибровочной кривой судили о количестве ЛПЛ в экстракте [Cheung et al., 1979]. Все это в данном случае было необходимо ввиду того, что в саму ЛПЛ метка включается плохо. В противном случае можно было бы использовать более простые методы, основанные на конкуренции антигенов и описанные ниже.
