Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
калибровочных кривых) смешивали с 10 мкл стандартного раствора всех [14С]-аминокислот, высушивали в вакууме и растворяли в 20 мкл 0,1 М триэтиламмонийбикарбонатного буфера, pH 9,7. Затем туда добавляли 3 мкл раствора рН]-ФДНБ (1 мКи/мл) в бензоле. Для перемешивания реактивов, находящихся в разных фазах, их кратковременно обрабатывали ультразвуком при 60°, затем смесь высушивали над концентрированной H2S04 и NaOH, растворяли в 2 мкл метанола и наносили на полиамидную пластинку для ТСХ размером 7,5X7,5 см. В первом направлении аминокислоты разделяли смесью толуол—СН3СООН (4: 1), а во втором — смесью НСООН—вода (6:7). Флюорография после обработки пластинок, как обычно, 7%-ным раствором ППО в эфире позволяла идентифицировать положения всех пятен аминокислот. Пятна вырезали, каждое элюировали 30 мин в 0,15 мл этанола, элюаты обрабатывали солюбилизатором и просчитывали в них двойную метку 3Н и 14С с учетом тушения. Для каждой из аминокислот заранее была снята калибровочная кривая, построенная, как описано выше, по степени изотопного разбавления, т. е. по отношению радиоактивностей 14С/3Н. Аминокислоты присоединяют [3Н]-ФДНБ, а затем разделяются ТСХ независимо друг от друга, поэтому одна описанная обработка эквивалентна анализу на содержание каждой аминокислоты в препарате.
В компьютер счетчика вводили все калибровочные кривые, и после просчета в определенном порядке элюатов всех пятен аминокислот прибор выдавал аминокислотный состав белка. Время, необходимое для анализа одного белка,— 24 ч, но оно определяется главным образом длительностью ТСХ, а ее несложно вести параллельно для нескольких белков.
Таким образом, можно обойтись и без дорогостоящего аминокислотного анализатора. Более того, метод двойной метки оказывается более гибким. Например, можно вести анализ только по некоторым интересующим аминокислотам, вырезая нужные пятна. Метод удобно использовать и для анализа белков бактериальной стенки, где присутствие большого количества аминокислот из пептидогликанов понапрасну перегружает аминокислотный анализатор, но не мешает разделению с помощью ТСХ.
Методом изотопного разбавления можно определять концентрации тех или иных биологических активных молекул в составе сложных смесей и физиологических жидкостей. Например, недавно этим методом определили концентрацию фактора элонгации eIF-2 в лизате ретикулоцитов [Safer et al., 1979].
Глава 7
РАДИОИММУННЫЕ МЕТОДЫ
В принципе большинство этих методов представляет собой варианты метода изотопного разбавления, где реакцией, выявляющей конкуренцию радиоактивных и нерадиоактивных (разбав* ляющих) предшественников, служит реакция образования иммунного комплекса антиген—антитело. Разнообразие радиоим-мунных методов связано главным образом с различием способов обнаружения этих комплексов или удаления их из раствора. Значение радиоиммунных методов для современной молекулярной биологии столь велико, что их необходимо рассмотреть подробнее и посвятить этому отдельную главу, тем более что это — методы новые и многие биохимики с ними еще плохо знакомы. Между тем, складывается впечатление, что в ближайшие годы ни одно серьезное исследование без них обойтись не сможет.
Использование радиоактивных изотопов в сочетании с иммунологическими методами исследования позволяет исключительную избирательность последних реализовать для ничтожно малых количеств биополимеров. Чувствительность радиоиммунных методов позволяет обнаруживать и определять нанограммовые, а иногда и пикограммовые количества индивидуальных белков и гормонов пептидной природы на фоне колоссального избытка родственных им молекул. Избирательность при работе с нуклеиновыми кислотами пока что заметно ниже (при том же уровне чувствительности метода), но прогресс и здесь явно заметен. Радиоиммунные методы широко используются для исследования* сахаров, липидов и других биологически активных соединений, однако эти приложения выходят за рамки настоящей книги.
В части II специальная глава была посвящена изложению необходимых основ иммунохимии. Чтобы не повторяться, будем считать, что читателю они уже известны. Описанные выше способы введения радиоактивной метки в белки и нуклеиновые кислоты позволяют получать меченные in vitro антигены и антитела с высокой удельной радиоактивностью. Чаще всего для этой цели используют радиоактивный иод. Особо важное значение имеет возможность получения в больших количествах радиоактивно меченного белка А из оболочки Staphylococcus aureus. Напомним, что этот белок обладает свойством «узнавать» и избирательно связывать константную часть большинства антител. Правда,, некоторые подклассы иммуноглобулинов (например, IgGl мыши) с белком А не связываются, так что возможность использования этого белка надо проверять. Меченный Ш1 белок А поставляется фирмой «Amersham» с УА>30 мКи/мг (каталог 1981 г.).
Общим подходом для всех рассматриваемых ниже радиоиммунных методов является преципитация (или сорбция) иммунного комплекса, в котором один из партнеров радиоактивен. При этом используются новые методы иммунопреципитации, не нуж-
