Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Прежде чем вернуться к самой реакции с участием Т4-поли-нуклеотидкиназы, необходимо упомянуть об источнике меченного по 7-фосфату АТФ с высокой удельной активностью. Сейчас ведущие фирмы («NEN», «Amersham») поставляют заказчикам еженедельно (У2Р)-АТФ с УА>-5000 Ки/ммоль. Можно готовить высокомеченный АТФ и самим — с помощью ферментативной
иимеьа между |0ез носителя) и нерадио-
активным АТФ с участием 3-фосфоглицераткиназы и глпцераль-дегид-3-фосфатдегидрогеназы [Махаш, Gilbert, 1977].
Т4-полинуклеотидкиназа способна присоединять у-фосфат из АТФ на 5'-ОН-концы однснитевых и двунитевых молекул ДНК и РНК* Краткие сведения о ферменте; Л1 = 140 ООО; рН0ПТ = 7,6; активаторы — Mg2H', полиамины, дитиотреитол (ДТТ); удельная активность — до 15 000 ед./мг; 1 ед. включает 1 нмоль 33Р в тимусную ДНК (активированную обработкой микрококковой нуклеазой) в условиях избытка субстратов за 30 мин при 37°. Хранят фермент в 0,05 М Трис-НС1, pH 7,6 (или в 0,02 М К-фос-фате, pH 7), с 0,03 М КС1, 5 мМ MgCl^ 5 мМ ДТТ, 0,1 мкМ АТФ и 50% глицерина при —20°. Перед использованием его разбавляют 0,05 М Трис-НС1 (pH 7,6) с 10 мМ ,р-меркаптоэтанола (или ДТТ) и 0,5 мг/мл БСА.
Введение метки в денатурированную ДНК осуществляют следующим образом. Малые и эквимолярные концентрации ДНК (по 5'-ОН-концам) и [7-3Ф]-АТФ инкубируют с несколькими единицами Т4-полинуклеотидкиназы в 0,1 мл 0,05 М глицин-NaOH (pH 9,5) с 10 мМ MgCU, 5 мМ ДТТ и 1 мМ спермидина при 37° в течение 30 мин. Для остановки реакции добавляют ОД мл 4 М CH3COONH4, 20 мкг тРНК-носителя и 0,6 мл этанола, выдерживают при —70° и центрифугируют при 12 000 g. Осадок промывают этанолом и сушат в вакууме.
Заметим, что эту реакцию проводят далеко не при оптимальном значении pH. Это оправдано стремлением сохранить ДНК в однонитевом, денатурированном виде. В других случаях лучше в качестве буфера использовать 0,07 М Трис-НС1 (pH 7,6).
Концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза
В английской литературе этот фермент часто обозначают со* кращенно «TdT» («Terminal deoxynucleotidyl transferase») или называют «ферментом Боллума» по имени его исследователя. Фермент выделяют из тимуса теленка. Он может присоединять ИР на З'-ОН-конец ДНК (но не РНК), однако лишь в составе дополнительного дезоксирибонуклеотида, за счет соответствующего нуклеозидтрифосфата, несущего радиоактивный фосфор в соположении. Присоединение идет к однонитевым молекулам ДНК или к неспаренным З'-ОН-концам рестриктазных фрагментов двунитевых ДНК. Процесс может не ограничиваться одним нуклеотидом — произойдет наращивание цепочки гомополимера. В ограниченной степени фермент присоединяет и рибо-нуклеотиды, но тоже только на З'-ОН-конец ДНК- Разумеется, если на 3-конца молекулы уже имеется фосфат, то его надо убрать с помощью фосфатазы, как было описано выше.
Краткие сведения о ферменте: 32 000; состоит из субъ-
единиц а и р с М 8000 и 24 000; активируется Mg2+ (присоединение пуриновых нуклеотидов) и Со2+ (присоединение пирими-
диновых); ингибируется хелирующими агентами (ЭДТА, о-фе-нантролином); рН0ПТ=7,2; удельная активность — до 20 000 ед./ /мг. 1 ед. присоединяет 1 нмоль дАМФ из дАТФ к (дТ), за 1 ч при 37°. Хранят фермент в 0,05—ОД М К-фосфатном буфере (pH 6,9—7,2) с 1 мМ ip-меркаптоэтанола и 50% глицерина при —20°. При разбавлении для сохранения активности фермента следует добавлять БСА до концентрации 30 мг/мл.
Используемый обычно для введения метки [а-а2Р]-АТФ поставляется с УА 2000—3000 Ки/ммоль. ДНК, растворенную в 0,01 М Трис-НС1 (pH 7,5) с 0,1 мМ ЭДТА, денатурируют нагреванием при 100° в течение 3 мин, быстро охлаждают и переводят в 0,1 М Na-какодилатный буфер (pH 6,9) с 1 мМ MgCl* и 0,1 мМ ДТТ. Количество [а-згР]-АТФ берут эквимолярным по отношению к ДНК (считая по З'-ОН-концам нитей); затем вносят соответствующее число единиц фермента. Инкубацию обычно ведут несколько часов при 37°. ДНК осаждают с тРНК-носи-телем и промывают этанолом, как указано выше [Maxam, Gilbert, 1977].
Фермент Боллума можно использовать для присоединения к З'-концу ДНК и других меченых или флюоресцирующих соединений. Для этого к ДНК описанным выше способом (с заменой MgCI2 на СоС12) присоединяют нерадиоактивный 4-тиоуридин. Далее готовят N-производное иодацетамида вида ICH2CONH— —R, где R может содержать любую радиоактивную или флюоресцентную метку. Отщепляя иод, это производное легко присоединяется по сере тиоуридина [Eshaghpour et al., 1979].
Т4-РНК-лигаза
Фермент выделяют из клеток Е. coli, зараженных фагом Т4„ С его помощью можно присоединять 32Р к З'-ОН-концу РНК, но только в составе некоего 5/,3/-нуклеозиддифосфата. Присоединение идет, в отличие от ДНК-лигазы, «на весу» — без участия матрицы. Сфера использования фермента, вообще говоря, значительно шире: он может «пришить» к З'-ОН-концу РНК (или ДНК) любой полинуклеотид, имеющий фосфат на своем 5'-кон-це. Для введения метки на З'-ОН-конец РНК в качестве донора радиоактивного фосфора чаще всего используют [5'-,2Р]-фЦф. Этот нуклеозиддифосфат поставляется с УА до 3000 Ки/ммоль. Удельная ферментативная активность продажных препаратов Т4-РНК-лигазы составляет примерно 1000 ед./мг. 1 ед. фермента включает 1 ммоль устойчивого к действию фосфатазы 32Р в поли (А) из [Б7-82?] олигорибоаденилата (в определенных условиях) за 30 мин при 37°. Хранить фермент следует растворенным в 0,02 М Трис-НС1 (pH 7,5) с 5 мМ р-меркаптоэтанола,
