Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 131

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 125 126 127 128 129 130 < 131 > 132 133 134 135 136 137 .. 140 >> Следующая

Следует привести некоторые, представляющие специальный интерес технические подробности этой работы. При очистке IgG на ЛПЛ-сефарозе элюцию иели 0,5 М NaCI в 0,2 М глицин-НС1, pH 2,8. Во фракции добавляли равный
объем 0,2 М Трис-НС1 (pH 8) для восстановления нейтральности среды. Объединенные фракции, содержащие анти-ЛПЛ-IgG, днализовали против фосфат-но*солевого буфера (0,01 М К-фосфат, pH 7,2+0,15 М NaCl) и концентрировали ультрафильтрацией. Метку в анти-ЛПЛ-IgG вводили из Na125I с помощью Н302 и иммобилизованной на сефарозе лактолероксидазы (фирмы «Sigma»). УА полученного препарата составила 2,5X10й имп./мин на 1 мкмоль. Для при-готовления иммуносорбента на гранулах «Immunobeads» 4,8 мг очищенного антй'ЛПЛ-IgG инкубировали со 100 мг гранул в течение Гч при 4° в 10 мл 3 мМ фосфатного буфера, pH 6,3, затем вносили 20 мг водорастворимого кар-бодиймида [1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид-НС1] и выдержи-вали в течение ночи на холоду. Сорбент тщательно промывали фосфатно-соле-вым буфером, потом отмывали от неспецифически сорбировавшихся белков 5 М раствором гуанидинхлорида в том же буфере и снова буфером. Перед использованием выясняли емкость полученного иммуносорбента. К 100 мкг гранул добавляли, в серии аликвот по 0,2 мл, постепенно возрастающие количества хорошо очищенной ЛПЛ (от 0,1 ХЮ^3 до бХЮ^3 мкг). Для уменьшения неспецифической сорбции «посадку» ЛПЛ на сорбент осуществляли в буфере, содержащем 0r75 М NaCl, 0,01 М Na-фосфэт (pH 7,4), 0,25% БСА и 14% глицерина. Такая концентрация соли не мешала образованию иммунных комплексов, но затрудняла сорбцию. Смесь инкубировали 1 ч при 20° и 1 ч при 4°, промывали порциями по 0,5 мл 1 М NaCl и ОД5 М NaCl в том же фосфатном буфере без прочих добавок и собирали центрифугированием. Осадок суспендировали в 0,2 М NaCl с 0,01 М Na-фосфатз (pH 7,4) и 10% глицерина, вносили избыток (1,25 мкг) радиоактивного анти-ЛПЛ-IgG, инкубировали, отмывали, как описано выше, и просчитывали связавшуюся с сорбентом радиоактивность в Y-счетчике.
После этого строили кривую насыщения иммуносорбента ЛПЛ и далее, при определении содержания фермента, не выходили за пределы линейного участка этой кривой (судя по радиоактивности). Этот участок и служил калибровочной прямой для определения неизвестного содержания ЛПЛ в препарате, который «сажали» на сорбент в точно таких же условиях.
Радиоактивно меченными могут быть и вторичные антитела в системе двух антител. Пример их использования приведен ниже, в одном из методов отбора гибридом.
Радиоактивно меченный белок А
Сам по себе белок А не участвует в иммунопреципитации, но если с помощью системы двух антител (или другим способом, оставляющим свободной константную часть иммуноглобулинов Fc) преципитат образован, то его количественную оценку или хотя бы радиоактивную маркировку можно осуществить с помощью радиоактивно меченного белка А. Как уже упоминалось, 1?5Ьбелок А имеется в продаже или может быть получен в лабораторных условиях.
В качестве примера приведем использование 1251-белка А для тестирования антисыворотки против актина [Lessard et al., 1979]. Очищенный актин «сажали» на BrCN-активирован-
ную сефарозу, получая иммуносорбент, В центрифужной полиэтиленовой пробирке на 0,25 мл в объеме 0,1 мл 0,01 М Трис-НС1 (pH 7,4) с 0,15 М NaCl и 5 мг/мл БСА (последний — для подавления за счет конкуренции неспецифической сорбции антител и 1251 белка А) смешивали и инкубировали этот иммуносорбент с антисывороткой, взятой в недостатке для обеспечен ния полного связывания специфических антител.
Несвязавшийся материал отмывали двукратным центрифугированием сорбента в том же буфере. Затем к суспензии сорбента со связанными на нем антителами против актина добавляли з избытке раствор 1251-белка А, инкубировали 10 мин, освобождались от свободного белка повторными промывками и последний осадок смывали из отрезанного кончика конической пробирки в сцинтиллятор для просчета радиоактивности.
Интересно отметить, что белок А не одинаково хорошо связывается с константной областью чистых IgG из крови разных животных. Например, IgG козы реагирует с белком А в 1000 раз менее эффективно, чем IgG кролика или человека. Вместе с тем, как было недавно показано, эта малая реакционная способность IgG козы увеличивается в 300 раз, если антитела находятся в составе иммунного комплекса с иммобилизованным антигеном, но не с антигеном в растворе [Langone, 1980], По* видимому, молекула белка А надежно связывается при взаимодействии с двумя молекулами IgG козы, которые для этого должны быть фиксированы в непосредственной близости друг от друга.
КОНКУРЕНТНЫЕ РАДИОИММУННЫЕ МЕТОДЫ (КРИМ)
Именно эти методы количественного определения антигенов чаще всего подразумеваются в английской научной литературе при употреблении термина «radioimmunoassay» (RIA). Сутънх заключается в следующем. Исследователь пользуется радиоактивно меченным антигеном, идентичным тому, который подлежит определению в препарате, и антисывороткой к этому антигену. Подбирают такое соотношение между ними, что в иммунной реакции радиоактивно меченный антиген оказывается в избытке, так что антисыворотка связывает лишь часть его стандартного исходного количества (50—80%). Доля связыва-ния определяется после удаления иммунных комплексов из раствора (путем преципитации, фильтрования или сорбции) по соотношению радиоактивностей — исходной и связанной с комплексом (или оставшейся в растворе). Затем в серии предварительных экспериментов к описанной выше стандартной исходной смеси добавляют известные, возрастающие количества чистого немеченного антигена. Между меченными и немеченны-ми молекулами антигена возникает конкуренция за находящиеся в недостатке антитела. В результате этого меченые антигены в составе иммунных комплексов разбавляются немеченнымц
Предыдущая << 1 .. 125 126 127 128 129 130 < 131 > 132 133 134 135 136 137 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed