Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Если индивидуальный белок, для которого очищается мРНК, имеется в достаточном количестве, то иммунопреципитацию можно осуществить и без помощи вторичных антител. После окончания избирательной реакции первичных антител с полисомами их можно связать добавлением избытка белка-антигена, также в виде нерастворимой сетки, сшитой глютаральдегидом. Напомним, что каждое антитело имеет два участка связывания антигена. Один из этих участков после присоединения антитела к полисоме остается свободным. По нему антитело, а через нее и вся полисома связывается с нерастворимой сеткой вносимого
белка-антигена. Этот прием был использован еще в 1974 г. для очистки овальбуминовой мРНК из гомогената яйцевода курицы [Schimke et al., 1974].
Использованный здесь прием внесения уже готовой к преципитации иммунной системы настолько удобен, что естественно было ожидать появления продажных препаратов такого типа, тем более что от вторичных антител не требуется специфической избирательности — они должны «узнавать» просто иммуногло* булины сыворотки первичного донора.
Действительно, французская фирма «International CIS» недавно начала производить «PR immuno-precipitating reagent». Это — не что иное, как пространственная сетка, образованная антителами овцы против иммуноглобулинов кролика и самими этими иммуноглобулинами из сыворотки нормального, неимму-низированного кролика. Пропорции компонентов в этой сетке подобраны таким образом, что антитела овцы находятся в достаточном избытке, чтобы дополнительно связать большое количество иммуноглобулинов кролика из раствора. Сетка измельчена в такой степени, что образуемые ею частицы могут длительное время оставаться в суспензии, откуда их легко осадить (вместе с захваченными специфическими иммунными комплексами) низкоскоростным центрифугированием. Отсутствие какой-либо несущей матрицы сводит до минимума (<2%) неспецифическую сорбцию белков на сетке. Связывание иммунных IgG из раствора занимает 15—30 мин.
Американская фирма «Bio-Rad» для этой же цели производит вторичные антитела, ковалентно связанные с поверхностью гидрофильных гранул на основе полиакриламида диаметром 5— 10 мкм. Фирменное название таких гранул — «Immunobead solid phase antibodies». В продаже имеются гранулы с наиболее употребительными антителами козы против иммуноглобулинов кролика, а также с антителами кролика против иммуноглобулинов козы, овцы, мыши, морской свинки, IgG, IgA и IgM человека. «Immunobeads» поставляются лиофилизированными или в виде суспензии, которая может храниться в течение месяца. После встряхивания суспензия остается стабильной в продолжение нескольких часов. Вместе с тем, «Immunobeads» можно легко осадить центрифугированием (1000 g; 5 мин) и промывать с переосаждениями. Активность антител на поверхности гранул достаточно высока — образование иммунных комплексов занимает 1—2 ч при 4°. Инкубацию ведут при pH 6—8 в присутствии 0,15 М NaCl. Концентрацию гранул в суспензии не имеет смысла поднимать выше 5 мг/мл. В большинстве случаев для осуществления радиоиммунной реакции (см. ниже) бывает достаточно 0,1 — 1 мг «Immunobeads»,
Антитела, фиксированные на гранулах «Immunobeads», можно использовать не только как вторичные, но и как первичные антитела для прямого осаждения антигенов или в конкурентных радиоиммунных системах. Разумеется, продажные «Immunobe-
ads» не обладают специфичностью к определенным белкам. Однако высокоспецифичные гранулы можно приготовить в лаборатории, если имеются хорошо очищенные специфичные антитела, с помощью поставляемого той же фирмой набора «Iinmunobead reagent coupling Kit». В этот набор входят свободные, незамещенные гранулы и водорастворимый карбодиимид для посадки любых антител на их поверхность.
Использование Staphylococcus aureus и белка Л, закрепленного на сефарозе
Белок А, способный образовывать прочные комплексы с Fc иммуноглобулинов, сохраняет эту способность и в составе стенки бактерии S. aureus. Через этот белок иммуноглобулины связываются с бактериальными клетками и вместе с ними могут быть легко осаждены низкоскоростным центрифугированием. Ни о каких пропорциях, кроме достаточного количества бактерий, заботиться нет необходимости.
Исследуя продукты трансляции мРНК интерферона человека in vitro, Вейссенбах и соавторы использовали эту возможность для иммунопреципитации интерферона [Weissenbach et al., 1979]. Антисыворотку против него получали в результате 6—10 подкожных инъекций кролику очищенного интерферона (2X10® ед./мл) в смеси с полным адъювантом Фрейнда дозами по 106 ед. с интервалами в 2—3 недели. Суммарную мРНК очищали иэ индуцированной к продукции интерферона культуры фибробластов человека. К 25 мкл инкубационной смеси на основе лизата ретикулоцитов, ведущей трансляцию этих мРНК, добавляли равный объем разбавленной в фосфатно-солевом буфере антисыворотки против интерферона и выдерживали 1 ч при комнатной температуре для полного образования иммунных комплексов. Затем добавляли 25 мкл суспензии убитых нагреванием и фиксированных формалином бактерий S. aureus. Авторы готовили препараты бактерий согласно первоначальной прописи [Kessler, 1975]. Следует помнить, что живые бактерии S. aureus патогенны и при работе с ними надо принимать все необходимые меры предосторожности. Сейчас убитые и подготовленные к использованию бактерии поставляются фирмой «Calbiochem» под торговым названием «Pansorbin» в виде 10%-ной суспензии клеток в фосфатно-солевом буфере с добавлением 0,1% азида натрия. 100 мг клеток связывают до 2 мг IgG.
