Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
кое время с целью наблюдения динамики использования изотопа для синтеза белков и НК, изучения времени жизни макромолекул, путей их метаболизма и трансформации. По окончании импульса биологический процесс нередко останавливают — животное забивают, суспензию клеток охлаждают и центрифугируют. Еще более плодотворно использование импульсной метки в так называемых «чейз-опытах» in vivo (от англ. «chase» — охота). Здесь по окончании импульсной метки выбранной длительности биологический процесс не прерывают, но прекращают поступление в исследуемую цепь трансформаций радиоактивного предшественника, заменяя его снова нормальным, немечен-ным препаратом. Это позволяет прослеживать во времени судьбу тех соединений и макромолекул, в которые радиоактивная метка успела попасть за время импульса.
Прекращения поступления или использования радиоактивного предшественника добиваются либо многократным его разбавлением «холодным» препаратом (для культур клеток и микроорганизмов), иногда с быстрой сменой питательной среды,, либо блокированием начальных звеньев цепи метаболизма предшественника, например путем введения антибиотиков и ядов с точно известным местом атаки.
После этих общих замечаний рассмотрим вкратце некоторые варианты и аспекты введения радиоактивности в белки и НК in vivo в зависимости от характера биологических объектов.
ВЫСШИЕ ЖИВОТНЫЕ
Долговременное введение изотопов для создания стабильного уровня меченых предшественников и синтезируемых на их основе макромолекул осуществляют через диету животного. Для этого используют меченые аминокислоты, ,4С-карбонат для общей метки всех биополимеров и др. Радикальное, импульсное введение изотопа производят путем внутрибрюшинных, подкожных или внутривенных инъекций.
В качестве радиоактивного предшественника ДНК удобен меченный по метилу тимидин, РНК — уридин или оротовая кислота, белков — аминокислоты, из которых предпочтение следует отдать лизину и лейцину, так как они в ходе метаболизма не превращаются в другие аминокислоты.
Что касается количества вводимых радиоактивных препаратов или уровня их содержания в диете и ее продолжительности, то в зависимости от вида животного, радиоактивности и усвояемости меченого предшественника, путей его метаболизма и, наконец, характера поставленной задачи диапазоны могут быть столь широкими, что нет смысла их здесь пытаться очерчивать. В каждом конкретном случае приходится опираться на имеющийся опыт или набирать его в серии собственных экспериментов.
Дополнительные возможности открывает использование двойной изотопной метки. Например, можно провести сопоставление времени жизни (скорости обмена) различных белков в организме или определенном органе. Сначала животному вводят меченную “С аминокислоту и выжидают 4—6 дней. За это время все меченные ею белки успевают частично разрушиться в соответствии с интенсивностью своего обмена. После этого вводят ту же самую аминокислоту, но меченную 3Н, и через 4—
6 ч животное забивают. К этому моменту 3Н-аминокислота успевает включиться во все новосинтезированные белки, и ее содержание характеризует их начальные концентрации. Между тем, уровень 14С-радиоактивностя для каждого из них будет тем ниже, чем дальше успел пройти процесс разрушения тех же белков, но первоначально меченных *‘С.
Сопоставляя отношения 5Н/14С для разных белков, можно сравнить скорости их катаболизма. Чем это отношение больше, тем короче время жизни соответствующего белка. Использование двойной метки здесь позволяет исключить из рассмотрения различие сопоставляемых белков по аминокислотному составу, а также неопределенность разбавления меченых аминокислот в собственном аминокислотном пуле организма — на значении отношения радиоактивностей эти факторы не могут сказаться [Schimke, 1975].
Иногда меченые аминокислоты выбирают с учетом известного состава сопоставляемых белков. Например, можно прослеживать параллельно синтез гистонов и негистоновых белков хроматина, если вводить животному одновременно [3Н] -триптофан и [14С]-лейцин, поскольку в составе гистонов нет триптофана.
Для сопоставления динамики синтеза ДНК и белков хрэма-тина можно вводить меченный SH по метильной группе тимидин одновременно с [|4С]-лизином.
В тех случаях, когда желательно свести до минимума разбавление радиоактивной метки в пуле целого организма и неопределенность уровня поступления ее с кровотоком к данному органу, можно воспользоваться перфузией. Например, меченую аминокислоту можно вводить в печень мыши in situ через портальную вену (под наркозом). Спустя определенное время после такого импульсного введения метки всю тушку животного надо быстро охладить в ледяной воде, а затем извлечь печень для анализа включения меченой аминокислоты в белки [Sato et al., 1979].
КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ВЫСШИХ ОРГАНИЗМОВ
Исследование клеточного метаболизма с помощью радиоактивных предшественников белков и нуклеиновых кислот удобно осуществлять на культурах клеток. Введение метки при этом происходит через питательную среду. Аминокислоты, как правило, хорошо проникают через наружные мембраны клеток и исполь-
