Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
К-фосфатном буфере (pH 7) с 1 мМ p-меркаптоэтанола и 50% глицерина при —20°. Для некоторых целей используется и продается отдельно фрагмент ДНК-полимеразы I с М 76 ООО. Этот фрагмент обладает полимеразной активностью, но лишен экзо-нуклеазной. Его иногда называют «фрагментом Кленова».
Реакцию трансляции от разрыва для двунитевой сверхскру-ченной ДНК вируса SV-40 проводили следующим образом.
1.8 мкг ДНК SV-40 растворяли в 120 мкл 0,05 М К-фосфатного буфера (pH 7,4) с 5 мМ MgCl2, содержащего дТТФ, дГТФ, дЦТФ и [а-згР]-дАТФ— по 15 мкМ каждого. Для активации ДНК добавляли в 10 мкл раствора 1 мкг ДНКазы I. Смесь выдерживали 1 мин при комнатной температуре и охлаждали до 14°. Затем в 4 мкл раствора для хранения (см. выше) вносили 6 мкг (~25 ед.) ДНК-полимеразы I. После 30-минутного лаг-периода включение згР в ДНК нарастало в течение 2 ч, а потом прекращалось. Затем добавляли 60 мкл 0,25 М раствора ЭДТА (pH 7,4) и прогревали инкубационную смесь при 68° в течение 10 мин. Этого достаточно для инактивации обоих ферментов. Очистку от трифосфатов проводили на сефадексе G-50. Подсчет показал, что замещалось от 25 до 50% всех нуклеотидов ДНК. Средняя длина полученных фрагментов ДНК — 400 пар нуклеотидов. Полученная активность была столь велика, что дозволяла обнаружить одну молекулу ДНК вируса на клетку хозяина (мыши) [Rigby et al., 1977].
Для сравнения можно указать, что в случае линейной двунитевой ДНК аденовируса-2 на 2 мкг ДНК, растворенной в 100 мкл 0,05 М Трис-НС1 (pH 7,8) с 5 мМ ip-меркаптоэтанола и 50 мкг/мл БСА, рекомендуется вносить на 10 мин при 15° всего лишь 10-4 мкг активированной охлаждением ДНКазы I, а затем 2 ед. ДНК-полимеразы I. Трансляцию ведут в течение 1 ч при той же температуре с участием [3Н]-дАТФ в концентрации
1.8 мкМ и трех немеченных трифосфатов в концентрации 18 мкМ. Различие, как легко видеть, особенно велико для подготовительной обработки ДНК действием ДНКазы I.
Следует отметить, что в ходе матричного синтеза ДНК ее можно пометить радиоактивной ртутью, если в качестве субстрата использовать [z03Hg]-AHTO, который включается в ДНК почти так же эффективно, как обычный дЦТФ. Ртуть легко присоединяется по С5 цитидина в реакции с участием меркури-ацетата [Dale et al., 1975]. [2“3Hg]-мер кури ацетат имеется в продаже с УА до 20 мКи/мг. Меркурированную таким образом ДНК при равновесном ультрацентрифугировании в градиенте плотности раствора CsaS04 легко отделить от обычной ДНК. Кроме того, она избирательно связывается с тиоловыми сорбентами [Bhattacharya, Sarkar, 1981].
В заключение следует упомянуть, что очистку меченых ДНК и РНК от радиоактивных предшественников при всех описанных методах введения 32Р удобно проводить путем центрифуги-
рования инкубационных смесей через микроколонки сефадекса или Биогеля Р-30. Колонку готовят из пластикового шприца на
2 мл (или из конической пробирки, проколов в ней отверстие). Сначала гель увлажняют буфером и центрифугируют в колонке (вставленной в центрифужную пробирку) при 250 g в течение 10 мин. Гранулы геля в колонке после этого кажутся сухими, но на самом деле внутри они заполнены жидкостью. Затем на колонку наносят 0,3 мл инкубационной смеси и снова центрифугируют. ДНК полностью выходит из колонки в наружную пробирку, а низкомолекулярные предшественники задерживаются внутри гранул [Spaeren et al., 1979].
Глава 5
ВВЕДЕНИЕ РАДИОАКТИВНОЙ МЕТКИ В БЕЛКИ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ IN VIVO
Этот подход к получению радиоактивно меченных биополимеров, не так давно универсальный, в настоящее время, особенно для высших животных, применяется все реже. Важнейшие причины этого перечислены ниже.
1. Развитие совершенных и мягких методов введения метки в очищенные препараты белков и НК in vitro с сохранением их физико-химических, а нередко и биологических характеристик.
2. Неизбежность включения изотопов, вводимых in vivo, через пути метаболизма во многие биополимеры, загрязняющие друг друга при последующем фракционировании.
3. Снижение и неопределенность УА радиоактивных предшественников, действительно используемых клеткой для синтеза биополимеров, ввиду разбавления их в собственном «пуле» клетки. Этот пул трудно поддается учету, так как его пополнение зависит от скорости протекания процессов катаболизма. Например, в печени около половины аминокислот, в том числе и «незаменимых», обязаны своим происхождением катаболизму собственных белков организма.
4. Значительно больший расход дорогостоящих радиоактивных препаратов.
5. Повышенная степень радиационной опасности ввиду использования больших количеств изотопов для питательных сред, а также проблема контроля радиоактивных экскрементов животных.
Разумеется, введение радиоактивной метки in vivo незаменимо при изучении физиологических аспектов метаболизма на клеточном и организменном уровне. Нередко для этой цели используют так называемую «импульсную метку», т. е. быстрое введение изотопа в организм животного (обычно путем инъекции) или в питательную среду клеток на относительно корот-
