Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
зуются ими для белкового синтеза. Если нет причин для специального выбора аминокислоты, удобно использовать метионин, поскольку его можно метить SH, иС и ,5S. В последнем случае нетрудно ввести в белок хотя и относительно короткоживущую, но очень интенсивную метку: [35S]-метионин поставляется с У А 500—600 Ки/ммоль. Кроме того, с метионина в большинстве случаев начинается синтез полипептидной цепочки, что позволяет исследовать скорости инициации белкового синтеза. Например, Олейник и Саленго с помощью [35S]-метионина определяли соотношение скоростей инициации и элонгации суммарного белкового синтеза в культуре клеток китайского хомячка. Для отделения концевых остатков метионина авторы использовали обработку полипептидов (на фильтрах) фенилизотиоцианатом, как: это делается при секвенировании белков по методу Эдмана [01еь nick, Salengo, 1976].
Используя двойную метку метионина, Бринстер и соавторы в изящных опытах исследовали времена жизни различных белков в бластоцистах мыши. Бластоцисты на четвертый день после оплодотворения вымывали из половых путей и в количестве 100—150 штук инкубировали в капельке (25—50 мкл) среды Кребса—Рингера под силиконовым маслом при 37°.
Для одной группы бластоцистов в капельку добавляли на 1 ч [3Н]-метионин с УА 80 Ки/ммоль до концентрации 29 мкМ. Затем туда же вносили большой избыток «холодного» метионина (до 5 мМ) и инкубировали еще 4 ч (чейз-опыт).
Другую группу бластоцистов инкубировали сначала в течение 4 ч без изотопа, потом на 1 ч добавляли [3SS]-метионин и промывали средой, содержащей 5мМ «холодного» метионина. Бластоцисты обеих групп смешивали, лизировали и проводили двумерное фракционирование их белков по методу О’Фаррелла (см. часть I). Пятна индивидуальных белков локализовали флюорографией, затем по шаблону рентгеновской пленки вырезали из геля, солюбилизировали и для каждого из белков просчитывали двойную метку 3Н и 35S. Отношение 3SS/3H служило мерой скорости распада белков. Измерения динамики выведения метки из белков и соответствующие расчеты позволили оценить и абсолютные времена полужизни 60 индивидуальных белков. Они оказались в пределах от 1 до 30 ч. Более половины белков имеют время полужизни меньше 10 ч [Brinster et al.,
1979].
Для получения меченой ДНК в питательную среду культуры клеток на 18—20 ч, т. е. на время, достаточное для репликации ДНК, вносят примерно 10 мкКи/мл 1®Н]-тимидина с высокой УА (до 100 Ки/ммоль). Импульсную метку в мРНК вводят с помощью [3Н]-уридина, внося его в питательную среду до концентрации примерно 0,2 мКи/мл на 1—2 ч. Поскольку УА [3Н]-ури-дина составляет около 50 Ки/ммоль, за это время можно получить включение 3Н в мРНК на уровне 108 имп./мин на 1 мг.
Можно для той же цели воспользоваться и [*2Р]-ортофосфатом без носителя. Клетки выращивают в суспензии на полноценной питательной среде до концентрации 4X105 кл./мл, затем собирают центрифугированием, промывают питательной средой без фосфора, суспендируют (2X10* кл./мл) в такой же среде с добавлением диализованной сыворотки теленка и на 2 ч вносят в эту среду [32Р]-ортофосфат до концентрации примерно 0,25 мКи/мл. Получается мРНК, высокомеченная радиоактивным фосфором.
Для исследования синтеза и процессинга ядерных предшественников мРНК в культуре клеток HeLa в питательную среду на 30 мин одновременно с [3Н]-уридином вносили в умеренном количестве актиномицин D (0,04 мкг/мл). Этого достаточно для блокирования синтеза рибосомальных РНК в ядрышке и включения изотопа только в пре-мРНК [Herman, 1979].
МИКРООРГАНИЗМЫ
Меченный по метилу [’Н]-тимидин за 1 ч легко включается в ДНК до уровня, составляющего около 10% от внесенной в среду радиоактивности. Меченную 32Р бактериальную или фаговую ДНК получают аналогично описанному выше для клеток в культуре, внося примерно 0,1—0,2 мКи [32Р] -ортофосфата на 1 мл среды [Grossman, 1967].
Контроль за этим включением удобно вести на нитроцеллю-лозных фильтрах. Аликвоты по 2 мкл бактериальной суспензии наносят на фильтр типа «Millipore НА». Бактерии на нем сорбируются. Их быстро промывают (трижды по 15 мл) 0,15 М раствором NaCI, а затем без вскрытия клеток (3fP!) в 10 мл воды просчитывают черенковское излучение. Выращивание бактерий прекращают при включении в них около 80% введенной в среду радиоактивности (можно сопоставлять с 2 мкл той же суспензии на фильтре без промывки).
Импульсную метку в мРНК бактерий осуществляют путем внесения в питательную среду [14С]-урацила (0,2—1 мКи/мл) или [32Р]-ортофосфата (0,5—2 мКи/мл — после и-счерпания или отмывки нерадиоактивного фосфора). Ввиду быстроты протекания процессов метаболизма у бактерий продолжительность такого импульса должна быть очень небольшой (10—30 с), поэтому приходится позаботиться о мгновенном прекращении жизнедеятельности микроорганизмов. Обычно этого достигают быстрым охлаждением, выливая суспензию на мелкораздробленный лед, содержащий азид натрия [Hayes, Gros, 1968].
Метку в бактериальные белки, как и в белки высших организмов, удобно вводить с помощью [,5S]-метионина. Например, в недавней работе [Horii et al., 1981] таким образом метили белки, синтезируемые на матрице ДНК плазмиды. 6 мл суспензии бактерий выращивали в среде М9 с 0,5% казаминовых кислот и 20 мкг/мл триптофана до плотности 2ХЮа кл./мл, облуча-
