Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 73. Типичная калибровочная кривая для конкурентного радиоим-мунного метода определения количества антигена
и соответственно снижается доля радиоактивности, выводимая этими комплексами из стандартного раствора.
о 1 10 юо юоо
Содержание антигена, хкг * W
Таким образом, можно построить калибровочную кривую (рис. 73), где по оси абсцисс откладывают количество
(или концентрацию) вносимого «холодного» антигена, обычно в логарифмическом масштабе, а по оси ординат — долю исходной радиоактивности (в процентах), связывающейся в иммунном комплексе (или остающейся в растворе). Теперь для выяснения содержания данного антигена в исследуемом препарате достаточно добавить известный объем последнего к той же стандартной смеси радиоактивного антигена и антисыворотки, отделить иммунные комплексы от раствора и просчитать радиоактивности. Зная долю связавшейся радиоактивности, по калибровочной кривой легко определить абсолютное количество данного антигена в препарате.
Конкуренция между радиоактивно меченными и иемечен-ными молекулами антигена может осуществляться как при одновременном, так и при любом последовательном внесении их в инкубационную смесь. Компоненты иммунных комплексов непрерывно обмениваются, и в конечном счете пропорция меченых и немеченных антигенов в составе комплексов устанавливается точно такой же, как в растворе. Полезно отметить также, что количество антигена в препарате может во много раз превышать количество радиоактивного антигена в исход* ной стандартной смеси, но это не помешает его точному определению, до тех пор пока остающаяся в составе комплекса (пусть даже малая) доля исходной радиоактивности измеряется надежно. Это означает, что в стандартную смесь можно вносить очень малое абсолютное количество высокомеченного антигена и соответственно иметь высокую чувствительность метода. Чувствительность, очевидно, определяется минимальным количеством «холодного» антигена, внесение которого дает эффект уменьшения связанной радиоактивности, надежно заметный на калибровочной кривой (~ I0-3 мкг для рис. 73).
В целом конкурентный радиоиммунный метод (КРИМ) прост, дает хорошо воспроизводимые результаты и очень чувствителен— можно определять нанограммовые количества антигенов. Ниже рассмотрены примеры его использования, сгруппированные по способам удаления иммунного комплекса из раствора. Большая часть этих способов подробно рассмотрена выше.
КРИМ с преципитацией иммунного комплекса
Из общей характеристики метода ясно, что определенные антигены и антитела против них не могут находиться в эквивалентном (для преципитации) соотношении, так как антитела должны быть в недостатке. Пространственная сеть при этом не образуется, и для осаждения иммунного комплекса должны быть приняты специальные меры.
Простейшая из них — осаждение раствором сульфата аммония с концентрацией около 50% насыщающей. Сульфат аммония в такой концентрации осаждает как свободные у-глобули-ны, так и иммунные комплексы. Для образования преципитата, как правило, приходится прибегать к соосаждению с носителем, в качестве которого можно добавить в смесь у-глобулины неиммунной сыворотки кролика до концентрации 1,5—2 мг/мл. В составе этих глобулинов, разумеется, не должно быть антител, способных вступать в иммунную реакцию с определяемым антигеном.
Таким способом, например, определяли в гидролизате РНК содержание некоторых минорных нуклеотидов (teA и ms2А). Антисыворотки против этих миноров были получены путем иммунизации кролика их конъюгатами с БСА. Метку SH в каждой из миноров вводили по методу Рандерата путем периодатного окисления остатка рибозы и последующего восстановления его меченым боргидридом натрия (см. выше).
В 0,3 мл буфера (0,075 М NaCl+0,1 М Н3В03+0,025 М N326407, pH 8,3) вносили иммунную сыворотку и меченые миноры одновременно с немечеиными (для калибровочной кривой) или с исследуемым гидролизатом РНК в пропорциях, продиктованных приведенными выше соображениями. Туда же для со-осаждения в стандартных условиях вносили у-глобулины кролика до суммарного содержания белка 0,5 мг. После инкубации в течение 1 ч при 37° смесь охлаждали, добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивали 30 мин при 0“ к осадок собирали центрифугированием. Его промывали 50%-ным (от насыщенного) раствором сульфата аммония, растворяли в том же буфере и просчитывали радиоактивность. По ее уменьшению при добавлении в стандартную смесь исследуемого гидролизата определяли содержание в нем минорных нуклеозидов [Void, 1979].
Часто для преципитации иммунных комплексов используют описанную в начале этой главы систему двух антител. Например, Форстнер и соавторы определяли этим способом содержание муцина в препаратах слизистой оболочки кишечника крысы. Антисыворотку кролика против чистого муцина концентрировали осаждением сульфатом аммония (с последующим диализом против фосфатно-солевого буфера) до 20 мг/мл. Метку тритием вводили, как и в предыдущем случае, по методу Рандерата в сахаридную часть муцина, который является гликопротеидом.
