Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
СКАНИРОВАНИЕ КОЛОНИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Брум и Гилберт использовали сорбцию белков на пластике для выявления колоний бактерий, продуцирующих определенный белок. К этому белку, используя его в качестве антигена, вырабатывали антисыворотку и ею смачивали поливиниловую пленку. IgG сорбируются на пластик так же, как другие белки. Колонии микроорганизмов, растущие на поверхности агара, ли-зировали в парах хлороформа или иным способом. На агар, слоем сорбированного белка вниз, накладывали пленку. В местах расположения колоний, продуцирующих искомые антигены, последние связывались со специфическими антителами и переходили на пленку. Затем пленку отмывали и обрабатывали радиоактивно меченными антителами той же самой специфичности. Эти индикаторные антитела в составе иммунных комплексов фиксировались на пленке в местах нахождения антигенов, связываясь с ними по второму антигенному детерминанту. Затем следовала авторадиография пленки, выявлявшая эти места, а тем самым и положение искомых колоний на поверхности агара I Broome, Gilbert, 1978].
Похожий прием был описан примерно в то же время Эрлихом и соавторами. Эта работа уже цитировалась подробно по другому поводу. Вместо пластиковой пленки авторы использовали диазобумагу (см. часть II); В роли радиоактивного маркера выступал иодированный белок А. Его «сажали» на индикаторные антитела, которые в этом случае были немеченными. Подобно предыдущему, авторадиографией диазобумаги можно было установить положение искомых колоний — продуцентов нужного бел-
ка-ангигена. Им был продукт трансляции встроенного в бактериальную плазмиду гена.
Во избежание связывания радиоактивного белка А с первым иммунным слоем последний формировали не из целых специфических антител, а из их фрагментов F<ab,)!!> полученных обработкой антител пепсином. Эти фрагменты, как известно, сохраняют способность связывать антигены, но не взаимодействуют с белком А. На рис. 30 изображена схема образующегося в местах расположения искомых колоний «сэндвича» [Erlich et al., 1978].
Диазобумагу (ДБМ-бумагу) можно использовать проще. Из лизатов бактерий на нее переводят все белки, а затем места локализации искомых антигенов выявляют, обрабатывая бумагу сначала раствором специфических первичных антител, а потом радиоактивно меченными вторичными антителами. Собственно говоря, это тот же самый прием использования системы двух антител, который был описан в части II для снятия иммунных реплик после электрофореза [Amster et al., 1980]. Вместо диазобумаги для такого сканирования можно использовать фильтровальную бумагу, активированную бромистым цианом [Clark et al., 1979; Kemp, Cowman, 1981].
Наконец, сканирование с помощью антигена, сорбированного на пластике, можно использовать для обнаружения лунок сгиб-ридбмами, ведущими синтез антител против этого антигена. Описанным выше способом отбирали гибридомы, продуцирующие антитела к некоему белку (фактору V), участвующему в коагуляции крови [Katzmann et al., 1981].
Изящный метод отбора колоний микроорганизмов или клеток в культуре, продуцирующих определенный антиген, связан с использованием индикаторных эритроцитов с закрепленным на их поверхности белком А. Такие клетки вносят в агар, на котором растет культура, одновременно с антисывороткой к нужному антигену и комплементом. Антитела через белок А связываются с поверхностью эритроцитов. В местах нахождения клеток, секре-тирующих антиген, он образует со связанными антителами иммунные комплексы. На них «садится» комплемент, что приводит в конце концов к лизису эритроцитов. Искомые колонии или клетки-продуценты антигена обнаруживаются по красным ореолам в местах их локализации [Smith, Hammarstrom, 1979].
ФЕРМЕНТАТИВНО-ИММУННЫЕ МЕТОДЫ
Эти методы не имеют прямого отношения к использованию радиоактивных изотопов. Следует кратко упомянуть о них лишь как об альтернативе рассмотренных радиоиммунных методов. В английской литературе ферментативно-иммунные методы обозначают сокращенно «ELISA», т. е. «enzyme-linked immunosorbent assay». В последние годы они приобретают все большую популярность. Суть дела заключается в использовании в качестве вторичных антител продажной антисыворотки козы против им-
муноглобулинов кролика, с которой ковалентно связан фермент, способный вести хорошо известную и легко обнаруживаемую реакцию, например щелочная фосфатаза или пероксидаза. Эта связь такова, что не сказывается на иммунореактивности антисыворотки и на активности фермента.
Опыт ставят точно по схеме, описанной выше для радиоим-мунных методов. Например, на полистироле сорбируют тестируемые антигены. К ним присоединяют специфические IgG кролика, а затем, вторым слоем,— связанную с ферментом антисыворотку козы. Теперь для обнаружения и количественной оценки послед* ней, а тем самым и исходного антигена, полистирольную пластинку инкубируют с субстратом ферментативной реакции, например n-нитрофенилфосфатом в случае щелочной фосфатазы. В результате ферментативной реакции освобождается /г-нитро-фенол, концентрацию которого можно определить спектрофотометрически. Выбрав концентрацию первичных антител так, чтобы они были в недостатке, и проводя прединкубацию сначала с известными количествами несвязанного антигена (для построения калибровочной кривой), а потом с исследуемым препаратом, можно использовать конкурентный метод, как было описано для радиоактивно меченных вторичных антител [Kucich et al., 1980; Sogin, Hinkle, 1980].
