Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Есть прием, где конкуренция происходит не между свободными антигенами в растворе за «посадочные места» на закрепленных антителах, а наоборот — между двумя твердофазными матрицами с закрепленными на них антигенами за связывание из раствора находящихся там в недостатке антител. Главное условие процесса сохраняется — недостаток антител. Матрицы при этом должны поддаваться последующему физическому их разделению. Антигены, «сидящие» на одной матрице, образуют стандартную систему сравнения (это как бы «известная концентрация») ; антигены, подлежащие определению, или известные количества антигена для калибровочной кривой «сажают» на вторую матрицу. Те и другие антигены — немеченные. Антитела распределяются между матрицами пропорционально количеству находящихся на них антигенов. Если затем матрицы разделить, то распределение антител можно выяснить с помощью обработки каждой из них избытком радиоактивно меченного белка А.
Недавно этот прием был использован для определения IgE (в качестве антигена) в крови человека. Для получения матрицы сравнения определенное количество IgE «сажали» с помощью карбодиимида на «Immunobeads» (см. выше). В качестве второй матрицы использовали «Protein А-Sepharose». На нее «сажали» сыворотку крови для определения в ней IgE. Сефарозу легко осадить из суспензии в условиях, когда «Immunobeads» еще остаются взвешенными. Тем самым происходит разделение матриц. В качестве антител были использованы продажные препараты IgG кролика против IgE человека [Langone et al., 1980].
Использование S. aureus. Выше было описано использование бактерий S. aureus для осаждения иммунных комплексов из раствора. Возможность такого использования связана с наличием в оболочках этих бактерий белка А, связывающего иммунные комплексы через остающиеся свободными константные участки антител, входящих в их состав. При использовании S. aureus в качестве твердофазной основы для КРИМ аналогичные события развиваются в ином порядке. Сначала с поверхностью бактерий связывают свободные антитела, сохраняющие при этом свою
иммунореактивность, а затем за образование комплекса с ними конкурируют радиоактивные и нерадиоактивные белки-антигены. После установления равновесия, отражающего соотношение тех и других антигенов в растворе, иммунные комплексы осаждают вместе с бактериями и просчитывают радиоактивность осадка, убывающую пропорционально увеличению концентрации нерадиоактивных антигенов. Таким образом, условия протекания реакций образования иммунных комплексов в двух сопоставляемых вариантах использования S. aureus различаются тем, что ранее эти реакции происходили в растворе, а сейчас речь идет о реакциях, идущих на «твердой» поверхности бактериальных клеток.
О’Киф и Беннет недавно использовали такой подход для обнаружения фактора роста в эпидермисе мыши. 0,5 мл 10%-ной суспензии убитых клеток S. aureus переводили в тот же объем буфера (0,01 М Ыа-фосфат, pH 7,5, с ОД М NaCI, 1 мМ ЭДТА и; 0,1% Тритона Х-100). Затем туда добавляли 0,1 мл неразбавленной антисыворотки кролика, иммунизированного фактором роста,, и смесь инкубировали 30 мин при 4°. От несвязавшихся компонентов сыворотки бактерии дважды отмывали тем же буфером (по 3,5 мл). Меченый фактор роста получали иодированием. Затем выясняли соотношение реагентов, обеспечивающее необходимый для конкуренции недостаток антител в реакции,— сначала в реакции с одним только меченым фактором роста.
К 20 мкл стандартизированного раствора меченого фактора-роста добавляли в серии проб по 20 мкл 1%-ной суспензии S. aureus, где бактерии, «заряженные» иммунным IgG, последовательно разбавляли бактериями, несущими на своей поверхности неиммунный IgG нормальной сыворотки кролика. Каждую пробу инкубировали в 0,4 мл того же буфера в течение часа на холоду. Для снятия неспецифически сорбировавшихся антигенов бактерии промывали 3 мл раствора следующего состава: 2 М мочеви-на+0,1 М глицин-f- 1%-ный Тритон Х-100. Наконец, их осаждала и просчитывали радиоактивность.
Таким способом находили разбавление, при котором уровень связывающейся бактериями радиоактивности снижался до 50— 75% от полной радиоактивности исходного стандартного раствора меченого фактора роста. Далее, как обычно для КРИМ, в-смесь стандартного раствора радиоактивно меченного фактора и найденного оптимального разбавления несущих антитела бактерий добавляли известные возрастающие количества «холодного» фактора роста и, аналогично предыдущему, по убыли осаждаемой радиоактивности строили калибровочную кривую. По этой кривой в тех же условиях определяли концентрацию фактора роста в исследуемом препарате [O'Keefe, Bennett, 1980].: Точно так же в качестве твердой фазы для КРИМ можно воспользоваться и «Protein А-Sepharose». Манипуляции с этим универсальным иммуносорбентом были описаны в начале главы.
Использование пластиков. Радиоиммунные методы сильно упростились и приобрели особенную привлекательность и популярность, когда выяснилось, что в качестве твердофазной основы для образования иммунных комплексов можно использовать обычные полистирол, поливинилхлорид и другие пластики, опираясь на явление сорбции белков на их поверхности.
