Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Содержание муцина, нкг*10
Рис. 74, Калибровочная кривая для определения содержания муцина в слизистой оболочке кишечника крысы [Forstner et al., 1977]
Для построения калибро* вочной кривой в инкубационную смесь вносили одновре^ менно 0,5хЮ_3мкг [3Н]-му-цина (14 000 расп./мин), от 0 до 0,2 мкг «холодного» муцина, 40 мкл разбавленной в 100 раз специфической антисыво^ ротки к муцину (fB недостатке!) и 96 мкл неиммунной сыворотки кролика (разбавленной в отношении 1 : 10). Последняя нужна только для того, чтобы обеспечить эквивалентное соотношение концентраций при последующей преципитации иммунных комплексов вторичными антителами. Здесь конкуренция меченого и немеченното муцинов происходила в самом ходе образования первичных иммунных комплексов. Инкубацию вели 1 ч при 37°. Затем добавляли неразбавленную антисыворотку козы против IgG кролика (продажный препарат) и смесь выдерживали 48 ч на холоду. За это время формировалась пространственная сеть преципитата. Его собирали низкоскоростным центрифугированием, промывали и просчитывали. На рис. 74 приведена калибровочная кривая из цитируемой работы. Ее почти линейный (в отличие от рис. 73) характер обусловлен тем, что на графике изображен только рабочий» близкий к линейному участок этой кривой. Чувствительность метода столь высока, что для количественного определения достаточно располагать участком слизистой оболочки площадью 2 мм3. Метод можно использовать для анализа биопсии у человека [Forstner et al.t 1977].
Одновременную инкубацию обоих конкурентов (меченого и немеченного миозина) с первичными антителами использовали Кларк и соавторы для отбора моноклональных гибридом — продуцентов антител против миозина. Роль иммунной сыворотки в этих опытах каждый раз играли среды культивирования различных гибридом, полученных в результате слияния клеток селезенки крыс и мышей, иммунизированных миозином, и клеток миеломной линии P3-X63-Ag8. Инкубацию проводили в борат-ном буфере (pH 8,4), содержащем 40 мМ пирофосфата натрия, по 1% Тритона Х-100 и дезоксихолата, а также 2% нормальной сыворотки крысы или мыши. Эту сыворотку вводили опять-таки ради создания эквивалентного соотношения концентраций при последующем добавлении вторичных антител в составе антисыворотки козы против иммуноглобулинов крысы или мыши. Использовав для конкуренции миозин гомологичного и гетеро-логичного происхождения, авторы выясняли степень специфич-
..___________ 1ПОП1
В недавней работе по исследованию содержания кальмоду-лина (многофункционального регулятора ферментов, использующих кальций) авторы сначала образовывали немеченный иммунный комплекс, а потом вели вытеснение из него «холодного» кальмодулина радиоактивным.
В 0,3 мл фосфатно-солевого буфера, содержащего 0.05% Тритона Х-10 и 3 мМ ЭГТА, 50 мкл разбавленной (1 :50) иммунной сыворотки кролика инкубировали в течение 30 мин при 30° с возрастающими количествами (1—10 мкг) немеченного кальмодулина. Только после этого вносили меченный ,г51 каль-модулин (— 13000 имп./мин), инкубировали смесь в течение 30 мин при той же температуре, а затем для достижения полного конкурентного равновесия ее выдерживали 24 ч на холоду. Добавляли 10 мкл неразбавленной антисыворотки козы против IgG кролика, инкубировали еще 14 ч, осадок собирали центрифугированием (20 000 g; 20 мин) и просчитывали в -р-счетчике, В точном соответствии с описанным построением калибровочной кривой осуществляли определение неизвестной концентрации кальмодулина в экстракте (до 60 мкг белка в препарате).
Иодирование кальмодулина в этой работе проводили с участием Хлорамина Т. Интересно, что антигенные свойства кальмодулина при иммунизации кролика улучшаются после присоединения к остаткам лизина в его молекуле динитрофенола из 1-фтор--2,4-динитробензола. Специфическую антисыворотку окончательно очищали на афинном сорбенте, полученном путем посадки кальмодулина на фирменный носитель «Affi-Gel 10» (фирмы «Bio-Rad»). Элюцию с него осуществляли 4 М тиоцианатом натрия [Wallace, Cheung, 1979].
Возможен и такой вариант постановки опыта, когда конкуренцию меченого и немеченного антигенов и даже само получение их иммунных комплексов проводят уже после образования пространственной сетки первичных и вторичных антител. Сначала смешивают в нужном соотношении специфическую антисыво* ротку кролика и антисыворотку козы против IgG кролика, инкубируют их для образования пространственной сетки, а потом вносят оба конкурирующих антигена. Такой прием, например, был использован при исследовании синтеза пептида, играющего роль «антифриза» в сыворотке крови рыб, живущих при —2°. Автор сначала смешивал по 50 мкл антипептидной сыворотки кролика, разбавленной в отношении 1 :50, и антисыворотки козы против IgG кролика, разбавленной в два раза (все в среде, содержащей 0,01 М Ыа-фосфат, 0,5 М NaCl, 5 мкМ лейцин, 1% Тритона Х-100 и 1% ДОХ-Na,—заметны меры по предотвращению неспецифической агрегации). Смесь инкубировали и уже после образования преципитата в нее вносили радиоактивно меченные продукты трансляции и конкурирующий с ними очищенный пептид [Lin, 1979]. Очевидно, что в такой постановке опыта можно с успехом использовать упомянутый выше готовый поепаоат «PR immuno-precipitating reagent».
