Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Не менее удобно вводить вторичные антитела закрепленными на полиакриламидных гранулах «Immunobeads». В этом случае отпадает необходимость обеспечения эквивалентности концентраций первичных (в роли антигенов) и вторичных антител, а следовательно, и введения для этой цели дополнительной неиммунной первичной сыворотки. При использовании такого подхода КРИМ с двумя антителами становится особенно простым и удобным.
Еще раз отметим частое введение 1% Тритона Х-100 и 1% ДОХ-Na. Они препятствуют неспецифической агглютинации, но не мешают образованию иммунных комплексов.
Естественно, что в конкурентном методе для осаждения иммунных комплексов находит широкое применение и второй из рассмотренных в начале главы современных подходов — использование бактерий S. aureus («Pansorbin») или «Protein А-Sepharose».
Например, в недавней работе по оценке содержания нейра-минидазы из Arthrobacter sialophilus в 0,2 мл буфера вносили 50 мкл антисыворотки морской свинки против нейраминидазы в разбавлении 1 :6000, различные количества очищенного фермента (для калибровочной кривой) или исследуемого препарата и 10"3 мкг [1251]-нейраминидазы (135000 имп./мин). Инкубацию вели в течение 3 ч при 23°. Для осаждения иммунных комплексов к инкубационной смеси добавляли 0,15 мл «Pansorbin». Через 10 мин осадок собирали центрифугированием. Следует обратить внимание на очень малое количество радиоактивного фермента и соответственно большое разбавление (1:6000!) антисыворотки, которая должна быть в недостатке. Такая высокая чувствительность метода возможна благодаря использованию высокоэффективного метода преципитации. Из рис. 75 видно, что в присутствии 2ХЮ-3 мкг «холодной» нейраминидазы уровень радиоактивности, связанной с препаратом «Pansorbin», уже снижается до 70% от максимального, а в присутствии 10-2 мкг «холодного» фермента можно зарегистрировать радиоактивность около 25% от максимума [Huchzermeier et al., 1980].
Для сопоставления рассмотрим еще одну работу по обнаружению кальмодулина конкурентным радиоиммунным методом, где для осаждения иммунных комплексов используется «Pan-sorbin». Инкубацию исследуемого препарата или известных количеств чистого антигена с антисывороткой овцы против кальмодулина проводили в 0,1 М боратном буфере (pH 8,4) с 0,06 М NaCl, 0,8 мМ ЕГТА и 16 мкг/мл БСА (конкурентное подавление неспецифической сорбции антигена) в течение 2 ч при 25° и ночи на холоду в присутствии 10 000 имп./мин [1241]-кальмодулина. Затем добавляли 10 мкл «Pansorbin», инкубировали еще 30 мин при 25°, центрифугировали (10 000 g; 15 мин), осадки трижды промывали тем же буфером и просчитывали в 7-счетчике [Cha-
1 ло f rtf о 1 1 Q7G1
2 д 4 5 10
Содержание хейра мииидязы}
МКг* UI3
^ " 8,1 0,5 1,0
Содержание ДДС ~ Na, %
2,5
Содержание NP-40, %
Рис* 75. Калибровочная кривая для определения содержания нейраминидазы в Arthrobacter sialophilus [Huchzermeier et aL, 1980]
a — доля от максимального связывания ,2*1 (в отсутствие «холодного» фермента)
Рис, 76. Осаждение иммунного комплекса в присутствии детергентов [Goelz et а!., 1981]
/ — NP-40; 2 — ДДС-Na; 3 — комбинация NP-40 и ДДС-Na в тех же концентрациях
Ранее отмечалось, что ДДС-Na мешает образованию иммунных комплексов. Между тем, в некоторых случаях этот детергент существенно облегчает экстракцию белка, необходим для его растворения или для подавления неспецифической сорбции легко сорбирующегося белка. Все это относится, в частности, к ней-рон-специфичному щелочному белку I из нервной ткани, где он содержится в концентрации меньше 0,001%. Поэтому при исследовании содержания этого белка была предпринята попытка использования КРИМ в присутствии ДДС-Na. Это оказалось возможным при условии, что одновременно в среду вводили пятикратный (против ДДС-Na) избыток нейтрального детергента NP-40. Образующиеся смешанные мицеллы успешно выполняли упомянутые защитные функции и, вместе с тем, не очень сильно снижали способность к образованию иммунных комплексов (рис. 76) [Goelz et al., 1981].
Иммунные комплексы антиген—антитело, сорбированные на поверхности клеток S.aureus, можно вместо центрифугирования собирать фильтрованием через стекловолокнистый фильтр, на котором можно и просчитывать радиоактивность осадка.
Наказато использовал этот прием для обнаружения немечен-ного гибрида РНК—ДНК. Против такого гибрида удается получить антисыворотку кролика. Как обычно для нуклеиновых кислот [Plescia, 1968], иммунизацию осуществляли его комплексом
г* мАтипмплпяипмм я Митрпррип гттп гтп.тпшйнттяя янти-
КРИМ с фильтрованием
сыворотка не взаимодействует с ДНК и РНК порознь, а «узнает» только гибридные молекулы. Меченный 3Н гибрид получали in vitro матричным синтезом РНК на однонитевой циркулярной ДНК фага фХ-174.
После инкубации (37°, 30 мин) в объеме 0,55 мл иммунной антисыворотки (0,1 мкг IgG), 5 пмоль меченого гибрида (1800 имп./мин) и возрастающих количеств немеченного гибрида (до 100 пмоль) к инкубационной смеси добавляли 5 мкл 10%-ной суспензии S. aureus и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. Затем добавляли I мл буфера и фильтровали через стекловолокнистый фильтр GF/F, предварительно вымоченный в том же буфере, содержавшем еще БСА (ОД мг/мл) и поливинилсульфат. Последние компоненты предназначены, по-видимому, для насыщения центров сорбции стекла, для того чтобы помешать задержанию на фильтре меченого гибрида ДНК—РНК, не вошедшего в состав иммунного комплекса. Фильтр промывали 5%-ной ТХУ и этанолом, сушили, а затем просчитывали в 10 мл сцинтиллятора «Econofluor» после растворения задержанного на нем материала в 0,5 мл солюбилизатора «Probosol» в течение 30 мин при 80° [Nakazato, 1979].
