Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
В этой работе задержание иммунных комплексов на фильтре было чисто механическим, за счет связывающих его бактерий, а сорбция на материале фильтра была явлением нежелательным. Однако существует и такой вариант КРИМ, когда задержание иммунного комплекса на фильтре происходит именно за счет сорбции. Это особенно удобно для антигенов небелковой природы, когда задержание на нитроцеллюлозном фильтре возможно только за счет антител, а они полностью входят в состав иммунных комплексов. Такой подход, например, был использован для обнаружения конкурентным методом минорного нуклеозида (feA) в составе полных гидролизатов различных тРНК [Khan et al., 1977].
Твердофазный КРИМ
Идея метода, завоевывающего все большую популярность, состоит в том, что один из компонентов иммунного комплекса химически или за счет сорбции надежно связан с неким твердофазным носителем, причем так, что не утрачивает своих иммунных свойств. Тогда образование иммунных комплексов и конкуренция между меченым и немеченным их участниками происходит на поверхности твердой фазы, которую затем легко промыть и просчитать в ^-счетчике.
По существу, твердофазная система использовалась уже довольно давно в виде геля, образованного самим белком-антигеном при сшивке его глютаровым альдегидом. На поверхность частиц измельченного гомогенизацией геля можно посадить специфические антитела так, что при этом будет занята лишь одна из двух областей связывания каждого антитела. За второе «посадочное место» может идти конкупенния мечены* и hpmpwhhmx
антигенов из раствора, что позволяет воспользоваться конкурентным радиоиммунным методом.
Однако такой подход не экономичен, поскольку требует расходования больших количеств чистого белка-антигена для образования геля. Естественнее использовать в качестве твердой фазы один из продажных гидрофильных гелей и на его поверхности химически закрепить антитела, за которые будет идти конкуренция. Такое закрепление можно осуществить, например, с помощью известной реакции активации сефарозы бромцианом. Она практически не нарушает иммунореактивности антител.
Использование сефарозы и ПААГ. Хамер и соавторы при определении р-глобина кролика получали для него антитела из антисыворотки козы н закрепляли их на BrCN-активированной сефарозе. Использовали [l2SI]-глобин с УА 10 мКи/мг. К 50 мкл 20%-ной суспензии сефарозы с антителами в микропробирке добавляли 0,4 мл исследуемого препарата и осторожно перемешивали (переворачивали) в течение 44 ч на холоду. Затем в объеме 25 мкл вносили 0,2X10-3 мкг [1251]-р-глобина (5000 имп./мин), перемешивали так же, осаждали сефарозу центрифугированием, замораживали в сухом льду, кончик пробирки отрезали и просчитывали находящуюся в нем радиоактивность в двухканальном у'Счетчике [Hamer et al., 1979].
Операция промывки сефарозы от не связавшегося с ней меченого р-глобина в этом описании не пропущена — ее просто не проводили. Вместо нее авторы использовали изящный прием учета радиоактивности свободного р-глобина в просчитываемом кончике микропробирки. Одновременно с [1451]-р-глобином в инкубационную смесь вносили 6000 имп./мин [59Fe] -трансферри-на, который, очевидно, не связывается с сефарозой. Это позволяло, просчитав во втором канале счетчика ¦у-излучение '9Fe кончика пробирки, оценить 1г51-радноактивность, находящуюся там в свободной жидкости. Для этого достаточно было выяснить отношение счета 125i/6i,Fe в аликвоте из супернатанта после осаждения сефарозы. Радиоактивность 1251, связавшуюся с антителами на сефарозе, легко подсчитать вычитанием найденной свободной радиоактивности 1г51 из суммарного счета иода в кончике микропробирки.
Закрепление антигенов на твердой фазе носителя упоминалось выше при рассмотрении иммуносорбентов, используемых для очистки антител. Такие сорбенты можно использовать и для количественных оценок, например, для определения концентрации специфических антител в растворе, где их содержание еще слишком мало, чтобы его можно было выявить обычными приемами титрования, описанными в части II. Такая задача возникает, например, в ходе отбора («сканирования») гибридом, синтезирующих нужные антитела. Находящиеся в недостатке антитела из раствора полностью переходят на иммуносорбент, где их легко обнаружить с помощью радиоактивно меченного белка А. Если последний взять в избытке и дать ему надежно прореагиро-
вать с «сидящими» на сорбенте антителами, а потом свободную радиоактивность отмыть, то активность, остающаяся на иммуносорбенте, может служить мерой количества антител. Белок А метят радиоактивным иодом, а сорбент прямо просчитывают в 7-счетчике.
Разумеется, здесь еще никакой конкуренции нет. КРИМ с использованием иммуносорбента с закрепленными на нем антигенами подобен рассмотренному выше варианту с гелем белка-антигена, сшитого глютаровым альдегидом. Как и там, антитела можно фиксировать на иммуносорбенте по одной области связывания (антигены на сорбенте закреплены и удалены друг от друга), а за вторую может идти конкуренция меченых и немеченных антигенов из раствора.
