Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
ли УФ-светом для стимулирования плазмидного синтеза и вы-рыцивали еще 16 ч. Затем клетки выдерживали в среде без серы в течение часа, вносили в нее [35S]-метионин и инкубировали с ним еще 1 ч. Меченые клетки отмывали от радиоактивной среды трехкратным суспендированием в 0,2 мл 0,05 М Трис-НСЦрН 8) с 10 мМ ЭДТА, добавляли 0,2 мг лизоцима и лизиро-вали тремя циклами замораживания и оттаивания. Затем проводили фракционирование белков электрофорезом в ПААГ и авторадиографию.
Для более полного включения радиоактивной метки удобно использовать мутантные штаммы бактерий, ауксотрофные по одной из аминокислот или тимину.
Сравнительно легко включают радиоактивную метку и дрожжи, Например, для осуществления импульсной метки нуклеиновых кислот в 2 мл суспензии дрожжей, выращенных на полной питательной среде до плотности 2,7X107 кл./мл, вносят на 15 мин при 30° 0,2 мК.и [3Н1-аденина с УА 55 Ки/ммоль. Рост клеток и включение изотопа останавливают разбавлением суспензии тремя объемами охлажденного до 0° буфера. В чейз-опьггах вместо этого в среду вносят большой избыток «холодного» аденина.
Метку в белки дрожжей можно вводить из I35S]-сульфата, который добавляют в питательную среду [Stephenson et al., 1980].
Глава 6
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ВЕЩЕСТВ МЕТОДОМ ИЗОТОПНОГО РАЗБАВЛЕНИЯ
Выбирают реакцию, в которой определяемое вещество может участвовать в качестве исходного субстрата, и отрабатывают ее сначала с радиоактивным препаратом вещества. Условия реакции должны быть подобраны так, чтобы включение радиоактивности в конечный продукт зависело не от концентрации радиоактивного предшественника, а только от его удельной активности. Например, можно использовать реакцию аминоацилирования тРНК радиоактивной аминокислотой, когда эта аминокислота и соответствующая синтетаза находятся в избытке, а тРНК — в недостатке. Внесение в такую реакцию дополнительного количества немеченного предшественника (здесь — аминокислоты) означает разбавление, а следовательно, снижение УА исходного субстрата. В указанных условиях это приведет к уменьшению радиоактивности конечного продукта реакции.
Добавляя в стандартную инкубационную смесь (с неизменным количеством радиоактивного предшественника) постепенно возрастающие количества нерадиоактивного предшественника и регистрируя каждый раз соответственно уменьшенный уровень радиоактивности продукта, можно построить калибровочную
кривую. С ее помощью в аналогичной реакции легко определить неизвестное количество предшественника, вносимое в стандартную смесь, а следовательно, и его концентрацию в обследуемом растворе.
Преимущество метода —в его потенциально большой чувствительности. Используя вещества с высокой УА, абсолютные количества участвующих в реакции соединений можно свести до минимума.
Если вещество, количество которого определяют описанным способом, само является радиоактивным, но меченным по другому изотопу, чем радиоактивный предшественник в стандартной смеси, то, используя приемы счета двойной изотопной метки, можно одновременно с количеством добавляемого в смесь реагента зарегистрировать и вносимую им радиоактивность. Это позволит определить УА исследуемого вещества.
Метод изотопного разбавления не обязательно связывать с химической реакцией, преобразующей исходные вещества в новые продукты. Достаточно иметь способ, позволяющий относить уменьшающуюся за счет разбавления радиоактивность к одному и тому же количеству смеси меченого и немеченного препаратов (по существу, то же самое происходит и при протекании реакции, где использование смеси предшественников лимитировано другими компонентами системы). Для определения неизвестной концентрации аминокислоты таким способом может быть, например, данзилирование.
Радиоактивные аминокислоты стандартного раствора и добавляемые к ним «холодные» аминокислоты известной (для калибровочной кривой) или неизвестной концентрации данзилиру-ются одинаково. Относя радиоактивность смеси к интенсивности ее флюоресценции после данзилирования, можно строить кривую изотопного разбавления. Замечательно, что здесь вовсе не требуется полнота данзилирования, лишь бы оно происходило воспроизводимо в стандартных условиях опыта и при построении калибровочной кривой. Еще удобнее для этой цели воспользоваться радиоактивно меченным по другому изотопу данзилхло-ридом [Airhartet а!., 1979].
Точно такой же подход был недавно использован для анализа аминокислотного состава белка, причем чувствительность метода, по утверждению авторов, не уступает самым лучшим аминокислотным анализаторам [Humphries, Thompson, 1980]. В качестве реагента, позволяющего стандартизировать суммарное количество радиоактивных и нерадиоактивных аминокислот, вместо данзилхлорида был использован [3Н]-1-фтор-2,4-динитро-бензол (ФДНБ). Авторы использовали препарат [3Н]-ФДНВ производства фирмы «Amersham» с УА 200 мКи/ммоль. В каталоге 1981 г. эта же фирма указывает для него УА 10— 30 Ки/ммоль.
10 мкл (1 мкг) полного гидролизата белка (6 н. НС1, 110°, 20 ч) или известной смеси «холодных» аминокислот (для построения
