Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
0,1 мМ ЭДТА, 50 мкМ АТФ и 50% глицерина при —20°.
Для проведения реакции в 10 мкл буфера (0,05 М HEPES, pH 7,5+15 мМ MgClj.-f3,3 мМ ДДТ+10 мкг/мл БСА+10% ДМСО) вносили 135 пмоль 5S РНК, 35 пмоль [5'-згР] фЦф„
525 пмоль АТФ и 2—5 ед, Т4-РНК-лигазы. Смесь выдерживали в течение ночи при 0°, а затем РНК очищали переосаждением или электрофоретически [Peattie, 1979]. В этой прописи обращает на себя внимание присутствие диметилсульфоксида и АТФ в концентрации около 50 мМ. Последний, по-видимому, участвует в активации З'-ОН-конца РНК.
К З'-ОН-концу тРНК радиоактивный фосфор из [<х-мР]-АТФ можно присоединить с помошью специфического фермента тРНК-нуклеотидилтрансферазы, ведущего в случае необходимости достройку ЦЦА-конца РНК, но способного катализировать и реакцию обмена концевого остатка адениловой кислоты (Renaud et al., 1979]. В тех случаях, когда не требуются высокие УА и энергия p-излучения згР, стабильную метку в тРНК вводят путем аминоацилирования меченной по 14С или 3Н аминокислотой.
ДНК-полимераза I из Е. coll (фермент Корнберга)
Если описанные ферментативные реакции позволяют осуществить включение згР только на один из заранее известных концов молекулы ДНК или РНК, то рассматриваемая ниже система позволяет получить нити ДНК, в которых практически весь фосфор представлен радиоактивным изотопом. Фермент ДНК-полимераза I из Е. coli, которому вначале приписывали функцию репликации, на самом деле играет основную роль в репарации ДНК. Особенно эффективно он начинает комплементарный синтез ДНК в точке разрыва одной из нитей, используя вторую нить в качестве матрицы. Такой синтез можно условно назвать «трансляцией от разрыва». В английской литературе этот процесс называют «nick translation» («nick» — разрыв, щель). Трансляция идет в направлении б'-^З' достраиваемой разорванной нити, т. е. начиная от З'-ОН-конца этой нити в месте разрыва. Как и для любого матричного синтеза ДНК, в качестве субстратов необходимы все четыре дезоксирибонуклеозид-трифосфата.
Замечательная особенность процесса трансляции от разрыва состоит в том, что (во всяком случае in vitro) он не ограничивается восполнением нуклеотидов, отсутствующих в месте разрыва, т. е. «заделкой» разрыва. Одновременно с синтетической фермент Корнберга обладает и экзонуклеазной активностью, причем также в направлении б'-^З'. Благодаря этому он убирает нуклеотиды, находящиеся впереди него в достраиваемой нити ДНК, уже за пределами первоначального разрыва, и тут же заменяет их на новые (в силу условия комплементарности— точно такие же) нуклеотиды за счет находящихся в среде нук-леозидтрифосфатов. Последние могут быть радиоактивно меченными либо по основаниям (14С, 3Н), либо по фосфору, стоящему в «-положении. В этом случае описанный процесс приводит к
синтезу нити ДНК, химически идентичной прежней, но радиоактивно меченной.
Введение радиоактивного фосфора в каждое нуклеотидное звено обеспечивает колоссальную радиоактивность продукта. Обычно в этом нет необходимости, так что ограничиваются использованием одного радиоактивного нуклеозидтрифосфата и трех немеченных, УА такой ДНК все равно оказывается огромной. Не следует забывать, что высокий уровень равномерного включения 32Р имеет свою оборотную сторону. Каждый единичный акт радиоактивного распада атома 32Р связан с превращением его в атом серы, что приводит к разрыву сахарофосфатной цепочки полинуклеотида. При хранении такого препарата ДНК в течение нескольких дней он будет заметно деполимер и-зоваться.
Трансляция от разрыва не может быть бесконечной. Через 1—3 ч in vitro, в зависимости от условий, она прекращается. Каждая молекула фермента успевает за это время заменить несколько сотен, но не тысяч нуклеотидов. Чтобы получить полностью меченный продукт, не довольствуются случайными разрывами в молекулах исходной ДНК, а вносят их преднамеренно путем кратковременной обработки этих молекул ДНКазой I. Это — довольно деликатная операция, так как оптимальное количество ДНКазы и время обработки ею сильно зависят от третичной структуры ДНК. Например, для кольцевых сверхскру-ченных ДНК фагов и плазмид требуется гораздо большая концентрация фермента, чем для линейных молекул. Вместе с тем, излишняя обработка ДНКазой приводит к чрезмерному укорочению получающихся фрагментов ДНК за счет многочисленных разрывов по двум нитям. Подбор условий обработки ДНКазой
I производят эмпирически.
Реакцию трансляции от разрыва следует вести при пониженной против обычной температуре (14—15°). При температурах выше 22° ДНК-полимераза I ведет не только замену нуклеотидов, но и некоторый дополнительный синтез ДНК, по-видимому* за счет смещения нитей. Последнее связывают с тем, что экзо* нуклеазная активность фермента более термолабильна, чем синтетическая. Включение радиоактивности в ДНК линейно зависит от концентрации радиоактивного трифосфата в смеси (при условии избытка немеченных трифосфатов) вплоть до соотношения: — 1 нмоль меченого трифосфата на 1 мкг ДНК.
Молекулярная масса фермента составляет 109 000. Он активируется MgJ+ с оптимумом концентрации около 7 мМ. Активность зависит и от концентрации одновалентных катионов. Ингибиторами фермента служат антибиотики, блокирующие матричный синтез ДНК. Удельная ферментативная активность продажных препаратов составляет 3000—5000 ед./мг‘1 ед. фермента, включает 10 нмоль нуклеотидов (суммарно) за 30 мин при 37° в находящуюся в избытке активированную ДНК или поли (АТ). Хранить фермент рекомендуется растворенным в 0,05 М
