Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Антитела, будучи белками, проявляют антигенные свойства в организмах других животных. Например, антитело, полученное из кроличьей сыворотки, при введении козе вызывает образование антитела. Антитело козы не реагирует с антигеномт который вызвал образование антитела кролика, однако реагирует с антителом кролика; его обычно называют антителом козы против антитела кролика.
Если биологическая активность вещества нарушается при воздействии антитела, то говорят о нейтрализации вещества.
Получение антител
Так как антитела вырабатываются в крови животных в ответ на введение инородного вещества, их можно получать из крови животных, которым несколько раз вводили один и тот же антиген или гаптен в виде конъюгата. Вследствие специфичности реакции Аг — Ат обычно нет необходимости выделять специфическое антитело или даже фракцию иммуноглобулинов. Таким образом, в большинстве иммунологических операций используется сыворотка крови, из которой все клетки удалены центрифугированием. Сыворотка, содержащая определенное антитело, называется антисывороткой. Существуют случаи, когда антисыворотку требуется подвергать частичной очистке. Например, если гаптен, связанный с сывороточным альбумином, вводить животному с целью получения антигаптена, в организме животного одновременно образуется антиальбумин сыворотки. Если получать антитело к УФ-облученной ДНК, то образуется также антитело, активное только против необлученной ДНК. Антитело к носителю может оказаться неприемлемым в данном эксперименте, и в таких случаях его необходимо удалить. Этот осуществляется с помощью адсорбции: к сыворотке добавляют антиген к нежелательному антителу, в результате чего образуется комплекс антиген — антитело. В определенных условиях этот комплекс можно
отделить центрифугированием. Повторное добавление антигена обычно приводит к полному удалению нежелательного антитела. Иногда бывает необходимо получить чистое антитело; оно может быть получено с помощью аффинной хроматографии (гл. 8).
Получение антигаптена требует специальных методов. Поскольку сам гаптен не иммуногенен, его связывают с сильно им-муногенными молекулами, такими, как альбумин бычьей сыворотки или некоторые синтетические полипептиды, и после этого вводят кролику. Связывание иногда вызывает трудности, поскольку гаптен должен содержать как минимум одну функциональную группу, которую можно использовать для связывания с доступной функциональной группой (например, амино, карбоксильной, фенольной, имидазолильной, сульфгидрильной, индолильной и гуанидино) белка в условиях, которые не приводили бы к разрушению как гаптена, так и белка. Другими словами, требуется получить химическое производное гаптена, с помощью которого можно осуществить связывание. В табл. 10-1 перечислены гапте-ны, к которым получены антитела. Возможность получения антител крайне важна для проведения радиоиммунологического анализа, что будет описано в дальнейшем.
ТАБЛИЦА Ю-1
Различные гаптены, к которым могут быть получены антитела3
Пептидные гормоны Непептидные гормоны
Коферменты
Витамины
Лекарственные вещества
Токсины
Канцерогены
а Полное описание см : Butler V. Р-, <1973).
Инсектициды
Углеводы (например, глюкоза, мальтоза, лактоза)
Катехоламины
Липиды
Стеориды о
Компоненты нуклеиновых кислот Растительные гормоны
Beiser S М , Advan. Immunol., 17, 235—31
Реакция антигена с антителом
После получения антитела проводят реакцию антиген — антитело путем смешивания этих двух веществ в буфере и инкубирования до тех пор, пока реакция не пройдет полностью. Буфер обычно обладает нейтральным pH и является изотоническим для предотвращения денатурации белкового антитела, хотя допускается колебание значений pH в пределах ±2 единицы, а для ионной силы возможен фактор 2.
Реакцию легко заметить, хотя она обычно проходит в сложных смесях, содержащих другие белки, небольшие молекулы, полисахариды, липиды и т. д., которые, как правило, не влияют на скорость и течение реакции. При количественных опытах обычно проводят контрольный эксперимент, чтобы убедиться в отсутствии в смеси мешающих веществ, так как в некоторых случаях реакционные смеси содержат вещества, которые разрушают либо антиген, либо антитело.
Иммунные реакции, используемые в биологическом анализе
Реакция преципитации
В определенных условиях прибавление антитела к раствору, содержащему антиген, приводит к образованию комплекса и преципитации. Количество антитела, преципитируемого различными количествами*антигена, зависит от соотношения антиген — антитело и описывается кривой преципитации (рис. 10-1). Преципи-тин отвечает определенному типу обратимо диссоциирующего комплекса антиген — антитело. Обратимость следует из того
Область
РИС. 10-1.
Кривая преципитации.
Различные количества антигена прибавляют к постоянному количеству антитела. После необходимой инкубации смесь центрифугируют и определяют количество преципитиро-ванного антитела путем измерения количества антитела, оставшегося в супернатанте, В области избытка антитела преципитируется весь антиген, т. е. супернатант содержит избыток антитела, В области избытка антигена ббльшая часть антитела не образует преципитата, поэтому супернатант содержит смесь антигена и антитела. При эквивалентности преципитируются полностью и антиген и антитело.
