Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
РИС. 9-9.
Типичная полулогарифмическая зависимость М от значения подвижности для определения молекулярной массы методом электрофореза в ДСН-полиакрил-а мидном геле.
Белки предварительно восстанавливали для удаления дисульфидных связей. / — альбумин бычьей сыворотки; 2 — каталаза; 3~ яичный альбумин; 4 — карбоксипептидаза А; 5 — хи-мотрипсиноген; 6 — лизоцим.
ется зависимость подвижности только от молекулярной массы за счет свойств геля быть молекулярным ситом. Если па колонке с гелем подвергнуть электрофорезу серию белков с известной молекулярной массой, то получим серию полос (рис. 9.8), причем график зависимости пройденного расстояния от lgM представляет собой прямую линию (рис. 9.9). Следовательно, если белок с неизвестной молекулярной массой подвергнуть электрофорезу с двумя белками известной молекулярной массы, неизвестная молекулярная масса может быть рассчитана с точностью от 5 до 10%. Большая точность получается, когда неизвестная молекулярная масса находится между известными. Несомненно, этот метод является на сегодняшний день наиболее распространенным для определения молекулярной массы субъединиц (следует заметить, что тонкослойная гель-проникающая хроматография, вероятно, будет иметь такую же значимость, см. гл. 8).
Заметим, что ДСН-гель-элекрофорез можно также использовать для определения наличия S-—S-групп, поскольку в присутствии этих групп подвижность будет зависеть от того, обработай ли белок агентом, расщепляющим S — S-связь, т. е. меркаптоэта-нолом. Приложение для решения этой проблемы метода вискозиметрии изложено в гл. 13.
В ранних работах для разрушения вторичной и третичной структуры белков использовали растворы мочевины с концентрацией от 7,0 до 12,0 М, однако сейчас такую обработку проводят ДСН.
Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидном и по-лиакриламид-агарозном гелях. При электрофорезе нуклеиновых кислот основным фактором разделения является эффект молекулярного сита, поскольку отношение заряд/масса приблизительно одно и то же для всех полинуклеотидов. Следовательно,
РИС. 9-10.
Разделение двух типов рибосомной РНК (16s и 23s) методами электрофореза в полиакриламидном геле и седиментации в градиенте плотности сахарозы.
Отметим, что электрофоретические зоны уже, чем седиментационные; кроме того, положение зон двух различных классов молекул оказывается обратным. А — электрофорез; Б — седиментация.
небольшие молекулы движутся быстрее, чем большие. Поскольку природные молекулы нуклеиновых кислот очень велики, размер пор геля должен быть большим, т. е. гель должен быть разбавленным. Для придания гелям прочности, особенно при разделении больших молекул (Л4>5*106), добавляют агарозу (высокопористый полисахарид); иногда используют одну агарозу. Электрофорез проводят на колонках или пластинках геля. Для молекул РНК (например, рибосомной или информационной РНК) метод дает гораздо лучшее разделение, чем зональное центрифугирование (рис. 9-10), поэтому часто в таких случаях выбирают электрофорез. Более того, проходимое расстояние пропорционально lg(l/M), т. е. возможно определить М при использовании двух параллельных образцов с известными молекулярными массами. Разделение в полиакриламиде и агарозе дает также хорошие результаты для одноцепочечных ДНК с молекулярной массой не выше 50* 106. Однако из-за большого размера двухцепочечной ДНК нельзя получить гель, размеры пор которого позволяют разделять ДНК с М более 8-106, хотя для ДИК с меньшей молекулярной массой разделение происходит очень хорошо. На рис. 9.11 показана пластинка геля агарозы с разделенными молекулами ДНК.
По неизвестным причинам одноцепочечные молекулы ДНК в некоторых буферных системах разделяются не только по размерам, но и по ряду других параметров. Например, две полинуклео-тидные цепи, полученные при денатурации ДНК некоторых фагов Е. coli, разделяются в 0,6%-ной агарозе с использованием трас-фосфатного буфера.
Другим интересным применением электрофореза в полиакриламидном геле служит разделение кольцевых и линейных молекул ДНК. Можно подобрать такую концентрацию геля, при которой в гель будут проникать только линейные, но не кольцевые молекулы ДНК одной молекулярной массы. Следовательно, кольцевые молекулы будут оставаться на старте. Это явление,
'W М -
ij Z* I 1
м k ч *4
Ы М 1
РИС. 9-11.
Электрофорез фрагментов ДНК на пластинке геля.
Фрагменты ДНК получены при обработке различных ДНК фага рага X Н1п2 и Hin3 рестриктазами. После электрофореза гель пропитывали раствором бромида этидия, облучали возбуждающим светом и фотографировали, фиксируя флуоресценцию красителя, связанного с ДНК. Так как при наличии связывания флуоресценция значительно усиливается, сам гель не дает заметной флуоресцении. Каждый вертикальный набор зон соответствует индивидуальной ДНК. (Любезно предоставил Роберт Шлейф.)
возможно, основано на том, что размер пор настолько мал, что лишь молекулы линейной формы, входящие в поры по ширине, могут проникать в гель. К настоящему времени этот метод еще не нашел широкого применения.
