Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Zweig GWhitaker J. R., Paper Chromatography and Electrophoresis* vol. 1; Electrophoresis in Stabilizing Media, Academic Press, 1967.
Задачи
9-1. Почему электрофорез проводят в растворах с низкой концентрацией солей?
9-2. Имеет ли значение в двумерной хроматографии н электрофорезе, какая операция выполняется в первую очередь?
9-3. Какие параметры (например, pH, ионная сила, температура и т. д.) требуется варьировать при определении условий максимального разделения двух компоненте*? Какое влияние будет оказывать на разделение изменение каждого из них?
9-4. Смесь белков подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле при трех различных значениях pH. В каждом случае можно было видеть пять зон. Можно ли с достаточным основанием утверждать, что в смеси присутствует только пять белков? Объясните.
9-5. Фермент был тщательно очищен. Ряд критериев свидетельствовал
о его чистоте ~ он давал один пик при хроматографии, электрофорезе или центрифугировании в различных условиях. При анализе методом ДСН-элек-трофореза получилось две зоны, причем площадь одной была в 2 раза больше, чем другой. Какую информацию о белке можно получить из этого факта? Поскольку чистоту всегда трудно удостоверить, считаете ли вы, что предположение было правильным? (Что может дать в этом случае гель-пропи-кающая хроматография?)
9-6. Вирус содержит 256 белков, 64 из которых имеют молекулярную массу 1800, а 192 — 26 000. Если вирус разрушить и проанализировать методом ДСН-гель-электрофореза, каковы будут относительные расстояния миграции и относительные площади зон?
9-7. Предположим, что вы выделили белок, обладающий двумя ферментативными активностями. Исходя из этого, вы предполагаете, что при очистке получилось два белка. Для проверки этого вы подвергли препарат электрофорезу в полиакриламидном геле при различных значениях pH. В каждом случае получалась единственная зона, однако более широкая, чем обычно, поэтому вы предположили, что она в действительности представляет собой две неразрешенные зоны. В ДСН-геле также получается одна широкая зона. Поскольку белки с двумя ферментативными активностями встречаются редко. следует внимательнее посмотреть, не является ли большая ширина зоны результатом наложения двух зон. Какие параметры вы можете варьировать для улучшения разрешения электрофореза? Какие другие неэлектрофорети' ческие методы могли бы здесь помочь?
Иммунологические методы
Идентификацию и анализ биологического материала чаще всего проводят с применением химических тестов, спектроскопических методов и определения различных физических параметров, например коэффициентов седиментации, электрофоретических подвижностей и т. д. Для анализа очень маленьких количеств традиционные химические методы оказываются непригодными; в этих случаях используют технику радиоактивных меток, описанную в гл. 5. К сожалению, при анализе сложных систем, таких, как клетки в культуре, а иногда и целые животные или растения, не всегда оказывается возможным вводить достаточное количество радиоактивного материала, чтобы пометить необходимое для анализа количество конкретного вещества — либо из-за разбавления, либо вследствие опасности для организма.
Иммунологические методы позволяют преодолеть эти трудности, поскольку они дают возможность анализировать минимальные количества нерадиоактивного материала в сложных смесях.
Иммунологическая система
В ответ на введение чужеродного вещества животному в его организме вырабатывается антитело (Ат), которое способно реагировать с введенным веществом. Антитела представляют собой белки, находящиеся в крови, и являются представителями класса сывороточных белков, называемыми иммуноглобулинами. Любое вещество, вызывающее образование антитела, называется антигеном (Аг). Антитело, образующееся при воздействии антигена, обладает важным свойством специфически реагировать с антигеном, который стимулирует его образование, но не с большинством других антигенов. Аналогичным образом антиген не способен реагировать с любым другим антителом кроме того, образование которого он вызывает.
Гаптен представляет собой вещество, которое само не может инициировать синтез антитела, но способно реагировать со специфическим к гаптену антителом. Большинство гаптенов представляют собой молекулы с низкой молекулярной массой (<;Ю00); антитела к гаптенам обычно получают путем химического связывания гаптена (с помощью ковалентной связи) с им-муногенным веществом, таким, как сывороточный альбумин, и
введением получаемого конъюгата животному (например, кролику). Антитело, полученное против вещества X (где X может быть как антигеном, так и гаптеном), обычно называется анти-Х. Комплекс антиген — антитело часто обозначают Аг — Ат.
Помимо иммуногена имеются и другие вещества, которые реагируют со специфическим антителом, хотя обычно с меньшей эффективностью. Такие реакции носят название перекрестных. Один из видов перекрестных реакций существует тогда, когда антиген А частично реагирует с анти-Б, а антиген Б частично реагирует с анти-А. Кроме того, существуют и асимметричные перекрестные реакции, когда антиген А реагирует с анти-Б, однако антиген Б не реагирует с анти-А.
