Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Необходимо помнить, что анализ ингибирования нельзя использовать для антигенов или даже антигенов, вступающих в перекрестную реакцию, в связи с тем, что в обоих случаях комплемент будет фиксироваться.
гаптена
РИС. 10-5.
Торможение с фиксацией комплемента.
Антиген, антитело и комплемент смешивают в таких количествах, чтобы количество комплемента соответствовало области избытка антигена на кривой, показанной на рис. 10-4. Перед прибавлением эритроцитов и антител против эритроцитов барана добавляют различные количества гаптена. Гаптен (Г) принимает участие в реакции антиген— антитело, приводя к уменьшению количества фиксируемого комплемента, поскольку Ат+Аг-ЬК'-^Ат-Аг-К', но Ат + Г+К'-^Ат-Г+К'. При добавлении неизвестного количества гаптена его можно определить по калибровочной кривой.
Антигены можно определять по ингибированию агглютинации. Суть этого явления состоит в том, что при взаимодействии бактерий и клеток в суспензии с антителами, направленными против компонентов поверхности клеток, клетки слипаются (агглютинируют), что бывает вызвано образованием комплексов антиген — антитело. Рассмотрим модификацию этой реакции, носящую название пассивной агглютинации. Антиген, к которому предварительно было получено антитело, связывается с поверхностью эритроцита или иногда с гранулами полистирола. Эта связь может осуществляться как путем адсорбции, так и с помощью ковалентного связывания. Прибавление антитела, полученного против связанного с поверхностью антигена, приводит к слипанию клеток или гранул, тогда как несвязанный антиген или гаптен будут конкурировать со связанным с поверхностью антигеном и предотвращать агглютинацию.
Одновременно можно проводить оба вида торможения. Однако эта процедура практически полностью вытеснена исключительно чувствительным методом радиоиммунологического анализа.
Радиоиммунологический анализ
Очень сложный вид иммунологического анализа, радиоиммунологический анализ (РИА), позволяет определять исключительно малые количества нерадиоактивного материала, причем при этом смесь может содержать большое число посторонних веществ в
« •
• •
радиоак-
тивный
нерайио-
аптивныи
антиген
?
? —¦ ?
антитело
О
О
и
комплекс Аг-Ат отделение
измерение
радиоактивности +
-—О G О
РИС. 10-6.
Принцип радиоиммунологического анализа. Подробное описание приведено в тексте.
Количество мескалина, лмоль
РИС. 10-7.
Типичная калибровочная кривая для радиоиммунологического анализа.
Различные количества немеченого мескалина смешивают с антителом против мескалина н 1251-мескалином. Калибровочную кривую строят по торможеншо преципитации радиоактивности при добавлении мескалина. (Любезно предоставила Хелен Ван Вунакис.)
любых количествах. Чувствительность метода равна или превосходит все известные хроматографические и спектрофотометрические методы. Метод применяется в основном для определения молекул, которые 1) нельзя метить редиоактивными изотопами in vivo с достаточной удельной активностью или нельзя пометить без того, чтобы не ввести метку и в другие вещества, 2) не способны фиксировать комплемент при реакции со специфическим антителом (например, гаптены) и 3) являются веществами, которые не идентифицированы, но вступают в перекрестную реакцию и поэтому конкурируют с известными антигенами.
Так как радиоиммунологический анализ представляет собой такой мощный метод, следует более подробно рассмотреть принцип использования процесса ингибирования. Это схематически показано на рис. 10-6. Антитело (Ат), полученное против антигена (Аг), полностью связывается радиоактивным Аг, обозначаемым Аг*, при использовании избытка Аг*. Если к Ат вместе с нерадиоактивным Аг добавить Аг*, то в комплексе антиген — антитело будет находиться меньшее количество Аг* при увеличении отношения Аг/Аг* (т. е. будет увеличиваться количество Ат — Аг и уменьшаться количество Ат — Аг*). Например, если Аг/Аг* =1, то будет связана только 7г Аг*, если Аг/Аг* = 2, то связана будет 7з и т. д. Если комплекс Ат/А г* с помощью ка-кого-либо физического метода можно отделить от Аг*, то при этом можно определить количество Аг.
Для измерения количества Аг строят калибровочную кривую (рис. 10-7). Для этого смешивают фиксированные количества Ат и Аг* и смесь распределяют по пробиркам. К каждой из пробирок добавляют известное количество Аг. После окончания реакции комплекс Ат — Аг* отделяют от Аг* (эта процедура описана ниже). Затем строят график зависимости радиоактивности отделенного Ат —Аг* от количества прибавленного Аг (рис. 10-7). Для определения количества Аг в экспериментальном образце пробу образца прибавляют к той же смеси Ат — Аг*, которая использовалась для построения калибровочной кривой, отделяют Ат—Аг* и измеряют радиоактивность, после чего количество Аг определяют по калибровочной кривой. Такое определение можно проводить в смеси со сколь угодно большим числом компонентов при условии, что в смеси ничто не влияет на реакцию Ат — Аг*.
